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アミロイドーシスの発症を誘導する腸内細菌由来機能性アミロイドの探索

寻找源自肠道细菌的功能性淀粉样蛋白，诱导淀粉样变性的发生

基本信息

批准号：
20K21291
负责人：
杉本真也
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、特定の腸内細菌が産生する機能性アミロイドが腸管などの末梢組織から中枢神経や全身に移行し、宿主のアミロイド前駆体タンパク質の構造変換を触媒することで、神経変性疾患を発症させるという新たな仮説を検証することである。前年度までの研究により、パーキンソン病患者において優位に増加することが報告されているCatabacter属細菌の機能未知タンパク質が、大腸菌の機能性アミロイドCurliの構成タンパク質CsgAと低いながらも相同性を示すことを見出し、本タンパク質をCatabacter amyloid-like protein A（CalA）と命名した。CalA遺伝子にCsgAのシグナルペプチド（1-20）および外膜輸送タンパク質CsgGの認識部位（21-43）を連結したキメラ遺伝子を合成し、大腸菌で複製可能なプラスミドのIPTG誘導型プロモーターの下流に連結することで、CalA発現プラスミドを構築した。そしてCurliの産生をネガティブに制御する複数の因子を欠損させた株にCalA発現プラスミドを導入し、コンゴーレッド含有培地上でアミロイド線維の産生を評価した。その結果、CalA発現プラスミド導入株のコロニーが微弱ながら赤色を呈した。Alpha-Fold 2を用いてCalAの立体構造を予測したところ、CalAのN末端は天然変性領域であり、C末端側に4本のβストランドからなるβシート構造を形成することが示唆されたため、CalAのC末端ペプチド（CalA-C）を化学合成し、アミロイド線維を形成するかを検証した。その結果、チオフラビンT蛍光の増大が認められ、透過電顕観察により、枝分かれのない線維構造を形成することがわかった。さらに、CalA-Cをもとに作製したアミロイド様線維をSeedとして、CalA-Cモノマーの凝集体形成が促進されることを明らかにした。

The purpose of this study was to demonstrate the functional nature of specific intestinal bacteria, their role in the development of intestinal diseases, their role in the migration of intestinal tissues, and their role in the structural transformation of intestinal tissues and host tissues. In the previous year's study, the function of Catabacter bacteria was unknown, the function of Escherichia coli was unknown, and the identity of CsgA and low protein was shown. CalA gene is linked to CsgA gene expression sites (1-20) and CsgG gene expression sites (21-43). CalA gene expression sites are linked to CsgA gene expression sites (21-43). CalA gene expression sites are linked to CsgA gene expression sites. The production of Curli is controlled by multiple factors, which are insufficient for the production of CalA. As a result, CalA appears to be a weak red color for the introduced plants. Alpha-Fold 2 is used to predict the three-dimensional structure of CalA, and the formation of the natural β-structure of CalA in the N-terminal region and the C-terminal region is demonstrated. CalA is chemically synthesized and formed in the C-terminal region (CalA-C). As a result, the increase of light intensity and the formation of line-dimensional structures through electrical observation are discussed. CalA-C is the only way to improve the quality of the product.