Development of a fluorescent GABA probe for analysis of pathological mechanism in autism spectrum disorder

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本研究課題では、自閉症病態において抑制性シナプス前部のGABA放出機能にどのような変化が生じているのかを調べるために、神経細胞のシナプス前部から開口放出されるGABAを計測するGABA蛍光イメージング技術の確立を目指している。本年度は、本研究課題で開発したGABA蛍光プローブを細胞膜上にストレプトアビジン-ビオチンを介して固定することで、培養神経細胞や脳スライス標本において抑制性シナプスから細胞外に放出されるGABAを定量的に計測する手法の構築を試みた。この手法では、GABA蛍光プローブをビオチン化し、ストレプトアビジンと混合することでストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの複合体を形成させ、ビオチン化した神経組織に複合体を添加することでGABA蛍光プローブを細胞膜上に固定する。ストレプトアビジン1分子あたりのGABA蛍光プローブの分子数を最大にし、GABA蛍光プローブを効率よく細胞膜上に固定するために、ストレプトアビジンとGABA蛍光プローブの混合比の異なる複数種類の複合体を、ビオチン化した非神経細胞の標本に個別に添加後、各細胞標本を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光画像の輝度値を比較した。その結果、細胞膜を最も明るく染色できる混合比を決定することができた。さらに、細胞膜上に固定したGABA蛍光プローブの性能を評価するために、GABA蛍光プローブを固定した細胞標本にGABAの終濃度が1 mM以上となるように高濃度のGABAを添加した。その結果、GABAの添加前後で蛍光強度が増加した。これらの結果から、GABA蛍光プローブは、細胞膜上に固定された環境下においてもGABAに対する応答性が維持されていることが明らかとなった。