Optical analysis of synaptic vesicle exocytosis by fluorescence GABA imaging with single synapse resolution

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当該年度では、単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングを可能にする高性能なハイブリッド型のGABA蛍光プローブの開発に取り組んだ。高性能なハイブリッド型のGABA蛍光プローブの開発は、GABA結合タンパク質上に標識する蛍光色素の最適な位置を探索することで行った。その際、網羅的に探索する場合と比べて、GABA結合タンパク質の立体構造情報をもとに探索する標識位置の数を10分の1程度に絞り込むことで、最適な標識位置の探索を効率化した。GABA結合タンパク質には、先行研究からGABAに結合することが報告されている細菌由来のタンパク質を採用した。また、蛍光色素には、外界の環境に応じて蛍光のON/OFFが切り替わる環境感受性蛍光色素を採用した。これらを材料に、システイン点変異を導入した組換えタンパク質を大腸菌発現系にて取得し、チオール基と特異的に反応する環境感受性蛍光色素を標識することでGABA蛍光プローブ候補を作製した。蛍光プローブ候補を効率的に作製するために、昨年度にGABA蛍光プローブのスクリーニングに最適化したHyFInDスクリーニングシステムを用いて、36種類のシステインの点変異体と、2種類の蛍光色素との組み合せからなる72種類の蛍光複合体を作製した。単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングを実現する上で蛍光強度変化の大きい蛍光プローブが望ましいため、GABA添加によって惹起される蛍光強度変化を指標にスクリーニングを行った。その結果、GABAに応答して蛍光強度が2倍以上変化する高性能な新規GABA蛍光プローブを10種類取得することに成功した。