難培養細菌の特性移植のためのマイクロ流路システムの開発

难培养细菌特性移植微通道系统的研制

基本信息

批准号：
21H01284
负责人：
石田忠
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、細胞融合に必要な、①プロトプラストの電気的細胞融合、②プロトプラストの細胞比制御、③薬剤濃度による一括淘汰、④デバイス内突然変異に関する技術開発に取り組んだ。①プロトプラストの電気的細胞融合：枯草菌のプロトプラストに対して電気的細胞融合を行った。電界、電圧、総パルス印加時間について破裂割合の条件探索を行った。破裂割合を50％程度に調整することで、電極間での細胞融合に成功した。②プロトプラストの細胞比制御：細胞比を制御するため、単一プロトプラストをスリットに吸引捕捉し、吸引圧を上昇することでプロトプラストを変形し、一つずつチャンバに導入する技術を提案した。デジタルミラーデバイスを用いた直描により、高さ1.8 μm幅1.0 μmのスリットを形成した。このスリットに対し、吸引圧をゼロから徐々に上昇すると、300 mbarを超えると単一プロトプラストがスリットに流れて捕捉され、340 mbarに到達するとスリットを抜けてチャンバに導入できた。③薬剤濃度による一括淘汰：薬剤濃度による一括淘汰のために薬剤濃度の異なる液滴を液滴輸送デバイスに導入するデバイスを提案した。異なる薬剤濃度液を形成する濃度勾配流路と液滴輸送デバイスは3次元的に接続する必要があるため、層間接続流路を開発した。直径200μmの層間接続流路により接続したところ、決壊圧だけで液滴サイズを制御することが困難であったため、層間接続流路上部に空圧バルブを実装した。これにより、10 nL級の液滴のサイズばらつきを1%以内で形成可能となった。④デバイス内突然変異に関する技術開発：液滴内の細菌に紫外線を照射し、細菌に突然変異を誘発して再び成長するための技術開発を行った。PDMSチャンバ内に形成した大腸菌懸濁液滴に波長254 nmの紫外線を照射したところ60秒程度の照射が望ましいことが分かった。さらに、大腸菌が紫外線ダメージ後の倍加時間が大幅に長くなることを示した。

今年，我们致力于开发与1）原生质体的电细胞融合有关的技术，2）原生质体的细胞比控制，3）基于药物浓度的大量选择，以及4）对细胞融合必不可少的intradevice突变。 1）原生质体的电细胞融合：对枯草芽孢杆菌的原生质体进行电细胞融合。搜索破裂速率的条件，以获取电场，电压和总脉冲施用时间。通过将破裂速率调整到约50％，电极之间的细胞融合成功。 2。原生质体的细胞比率控制：为了控制细胞比率，我们提出了一种一种技术，其中将单个原生质体被吸入并捕获在缝隙中，并且通过增加吸力压力，将原生质体变形并一一引入腔室中。通过使用数字镜设备直接绘制形成高度为1.8μm，宽度为1.0μm的缝隙。当吸力压力从零逐渐增加时，当吸力压力超过300 mbar时，单个原生质体被流入缝隙并捕获，当它达到340 mbar时，它可以通过狭缝并引入腔室。 ③基于药物浓度的裸体选择：我们提出了一种设备，将具有不同药物浓度的液滴引入液滴传输装置中，以基于药物浓度进行大量选择。由于需要三维连接，形成不同药物浓度液体和液滴转运设备的浓度梯度流动路径，因此开发了层间连接流道。当层间连接流动路径通过直径200μm连接时，很难仅使用故障压力来控制液滴尺寸，因此将气动阀安装在中间层连接流动路径的顶部。这使得在1％以内形成10 NL液滴的尺寸变化。 ④设备中突变的技术开发：我们开发了技术来照射具有紫外线射线的液滴中的细菌，从而诱导细菌中的突变和重新生长。当在PDMS腔室中形成的大肠杆菌悬浮液液滴被带有254 nm波长的紫外线照射时，人们发现受照射约60秒。此外，显示大肠杆菌在紫外线损伤后的双倍时间明显更长。