難培養細菌の特性移植のためのマイクロ流路システムの開発

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本年度は、細胞融合に必要な、①プロトプラストの電気的細胞融合、②プロトプラストの細胞比制御、③薬剤濃度による一括淘汰、④デバイス内突然変異に関する技術開発に取り組んだ。①プロトプラストの電気的細胞融合：枯草菌のプロトプラストに対して電気的細胞融合を行った。電界、電圧、総パルス印加時間について破裂割合の条件探索を行った。破裂割合を50％程度に調整することで、電極間での細胞融合に成功した。②プロトプラストの細胞比制御：細胞比を制御するため、単一プロトプラストをスリットに吸引捕捉し、吸引圧を上昇することでプロトプラストを変形し、一つずつチャンバに導入する技術を提案した。デジタルミラーデバイスを用いた直描により、高さ1.8 μm幅1.0 μmのスリットを形成した。このスリットに対し、吸引圧をゼロから徐々に上昇すると、300 mbarを超えると単一プロトプラストがスリットに流れて捕捉され、340 mbarに到達するとスリットを抜けてチャンバに導入できた。③薬剤濃度による一括淘汰：薬剤濃度による一括淘汰のために薬剤濃度の異なる液滴を液滴輸送デバイスに導入するデバイスを提案した。異なる薬剤濃度液を形成する濃度勾配流路と液滴輸送デバイスは3次元的に接続する必要があるため、層間接続流路を開発した。直径200μmの層間接続流路により接続したところ、決壊圧だけで液滴サイズを制御することが困難であったため、層間接続流路上部に空圧バルブを実装した。これにより、10 nL級の液滴のサイズばらつきを1%以内で形成可能となった。④デバイス内突然変異に関する技術開発：液滴内の細菌に紫外線を照射し、細菌に突然変異を誘発して再び成長するための技術開発を行った。PDMSチャンバ内に形成した大腸菌懸濁液滴に波長254 nmの紫外線を照射したところ60秒程度の照射が望ましいことが分かった。さらに、大腸菌が紫外線ダメージ後の倍加時間が大幅に長くなることを示した。