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多色リアルタイム発光測定法によるストレス応答経路間のクロストークの解明

使用多色实时发光测量方法阐明应激反应途径之间的串扰

基本信息

批准号：
21H02083
负责人：
中島芳浩
金额：
$ 11.15万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、独自に創出した多色リアルタイム発光測定法により、ストレス惹起時に起こる細胞内の主要なストレス応答経路の動的変動を正確に捉え、ストレスから回避する際、そして回避できず恒常性維持が破綻する際のストレス応答経路間のクロストークを明らかにするとともに、直感的に理解し易いシンプルなネットワーク構造として「見える化」することを目的とする。今年度は、ストレス応答経路解析用の発光細胞の樹立と作動性検証を行った。最初に、毒性モニターの実績がある緑色発光レポーターベクター（恒常的プロモーターと緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター）を、予め人工染色体ベクターが導入されたヒト骨肉腫由来U2OS細胞、ヒト子宮癌由来HeLa細胞、マウス線維芽細胞A9細胞の標的部位に相同組換えにより挿入し、緑色発光細胞を作製した。続いて、これらの細胞に解析対象であるストレス応答経路（酸化ストレス応答、炎症応答、小胞体ストレス応答、熱ショック応答、浸透圧ストレス応答）の鍵転写因子の応答配列を搭載した赤色発光レポーターベクターを人工染色体ベクター内の標的部位に相同組換えにより挿入することで、各種ストレス応答経路解析用の発光細胞を樹立した。続いて、樹立した細胞の作動性を検証するため、既に樹立済みのHepG2細胞とともに、各ストレス応答経路を特異的に活性化する薬剤を処理し、リアルタイム発光測定により鍵転写因子の活性化を確認したところ、いずれの細胞も既に作動性を検証済みのヒト肝癌由来HepG2細胞と類似した活性化キネティクスを示すが確認された。以上の結果より、今年度樹立した発光細胞群は当該研究で目的とするストレス応答経路間のクロストーク解析に使用できることが示唆された。

This study independently developed a polychromatic luminescence assay to detect, avoid, and maintain the variability of the major intracellular pathways during initiation and during response time. Intuitive understanding of the structure of the structure of the "see" and "purpose" This year, the light emitting cells used for the analysis of the optical circuit are established and the kinetic model is performed. Initially, toxicity test results showed that green light-emitting cells were introduced into the target sites of U2OS cells, HeLa cells, and A9 cells by artificial chromosomes. In addition, the key writing factors for the analysis of cell pathways (acidification, inflammation, microcellular pathways, heat, saturation) are arranged in the same group of light cells for the analysis of various pathways. The activity of HepG2 cells in vitro was demonstrated by the activity of HepG2 cells in vitro and the activation of HepG2 cells in vitro. The activation of HepG2 cells in vitro and HepG2 cells in vitro was confirmed by the activity of HepG2 cells in vitro and the activation of HepG2 cells in vitro. These results demonstrate the utility of this study in establishing a light-emitting cell population for the analysis of cellular pathways.