多色リアルタイム発光測定法によるストレス応答経路間のクロストークの解明

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本研究は、独自に創出した多色リアルタイム発光測定法により、ストレス惹起時に起こる細胞内の主要なストレス応答経路の動的変動を正確に捉え、ストレスから回避する際、そして回避できず恒常性維持が破綻する際のストレス応答経路間のクロストークを明らかにするとともに、直感的に理解し易いシンプルなネットワーク構造として「見える化」することを目的とする。今年度は、ストレス応答経路解析用の発光細胞の樹立と作動性検証を行った。最初に、毒性モニターの実績がある緑色発光レポーターベクター（恒常的プロモーターと緑色発光ルシフェラーゼを連結したベクター）を、予め人工染色体ベクターが導入されたヒト骨肉腫由来U2OS細胞、ヒト子宮癌由来HeLa細胞、マウス線維芽細胞A9細胞の標的部位に相同組換えにより挿入し、緑色発光細胞を作製した。続いて、これらの細胞に解析対象であるストレス応答経路（酸化ストレス応答、炎症応答、小胞体ストレス応答、熱ショック応答、浸透圧ストレス応答）の鍵転写因子の応答配列を搭載した赤色発光レポーターベクターを人工染色体ベクター内の標的部位に相同組換えにより挿入することで、各種ストレス応答経路解析用の発光細胞を樹立した。続いて、樹立した細胞の作動性を検証するため、既に樹立済みのHepG2細胞とともに、各ストレス応答経路を特異的に活性化する薬剤を処理し、リアルタイム発光測定により鍵転写因子の活性化を確認したところ、いずれの細胞も既に作動性を検証済みのヒト肝癌由来HepG2細胞と類似した活性化キネティクスを示すが確認された。以上の結果より、今年度樹立した発光細胞群は当該研究で目的とするストレス応答経路間のクロストーク解析に使用できることが示唆された。