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灌流培養型連続発光モニター系を用いた概日リズムの同調機構解析

利用灌注培养式连续发光监测系统分析昼夜节律的夹带机制

基本信息

批准号：
16790148
负责人：
中島芳浩
金额：
$ 2.24万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

生体時計の作り出す自律的リズムの周期は正確に24時間ではないため、環境サイクルとの時間差を同調機構によって日々修正している。しかし、24時間サイクルを刻む発振制御系と同調機構に関する分子メカニズムは不明な点が多い。本研究は新規発光モニター系を用い、時計遺伝子発現を非侵襲的にリアルタイムモニタリングすることで、生体時計の発振・同調機構の分子機構解明を目的としている。本年度の研究実績は以下の通りである。(1)概日時計遺伝子Bmal1のプロモーター領域の下流に分泌型ウミホタル由来ルシフェラーゼを連結したベクターを構築、これをラット繊維芽細胞に導入し、安定細胞株を作製した。灌流培養しながら30分間隔で培養液を分画し、各画分の発光活性を測定したところ、約24時間の周期での変動が認められ、ウミホタルルシフェラーゼをレポーター遺伝子として用いた灌流培養系により、Bmal1遺伝子発現の日周変動が連続測定可能なことが明らかとなった。続いてこのシステムを用い、抹消組織の同調因子候補とされるグルココルチコイド系ホルモン、デキサメタゾンのアンタゴニストを灌流培養系でパルス処理した所、Bmal1発現の位相が遅延することが判明し、デキサメタゾンがグルココルチコイド受容体を介して直接抹消組織の同調に関与することが示唆された。(2)概日時計遺伝子Per1のプロモーター領域の下流にウミホタルルシフェラーゼを、Bmal1プロモーター領域の下流にホタルルシフェラーゼを連結し、同一コンストラクション上で2種のプロモーターの変動を同時測定可能なベクターを構築、これを導入したトランスジェニックマウスを作製した。生体時計の本体である視交叉上核のスライス培養を行い、2つのルシフェラーゼ活性を経時的に測定したところ、内因性のmRNAの変動と同様、2種の発光活性の変動は逆位相を示し、生体時計の発振・同調機構を解明するための優れたモデル動物およびレポーター系であることが判明した。

The time difference between biological time and self-discipline is corrected by the time difference between biological time and environment. 24-hour transmission control system, coherence mechanism, molecular mechanism, unknown point This study aims to develop new methods for the detection of photoreceptors, the detection of chronoreceptors, the non-invasive detection of photoreceptors, the detection of biochronoreceptors, and the elucidation of molecular mechanisms for coherence mechanisms. This year's research achievements are as follows: (1)In this paper, we introduce the expression vector Bmal1 into the cell culture system and establish a stable cell line. Perfusion culture was carried out at intervals of 30 minutes, and the photoactivity of each fraction was measured at intervals of about 24 minutes. In the case of a tissue, the homology factor candidate is deleted, and the homology factor candidate is deleted. In the case of a perfusion culture system, the homology factor candidate is deleted, and the homology factor candidate is deleted. In the case of a perfusion culture system, the homology factor candidate is deleted, and the homology factor candidate is deleted. (2)In general, the time table indicates that the movement of two kinds of mobile phones in the downstream of the mobile phone Per1 and the downstream of the mobile phone Bmal1 are linked, and the movement of two kinds of mobile phones in the same mobile phone is simultaneously measured. In vivo chronology, the expression of DNA in the nucleus of the optic chiasm was cultured, the expression of DNA in the nucleus of the optic chiasm was measured, the expression of DNA in the nucleus of the optic chiasm was determined, and the expression of DNA in the nucleus of the optic chiasm was determined.