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Development of analytical method for DNA hydroxymethylcytosine and biological significance of hemi-modification of cytosine.

DNA羟甲基胞嘧啶分析方法的建立及胞嘧啶半修饰的生物学意义。

基本信息

批准号：
21H02154
负责人：
幸田尚
金额：
$ 11.23万
依托单位：
University of Yamanashi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02154/
关键词：
ヒドロキシメチルシトシンメチルシトシンエピゲノム解析

项目摘要

我々はメチルシトシン(mC)の脱メチル化反応に関わることが明らかになったヒドロキシメチルシトシン(hmC)を、mCや非修飾のシトシン(C)と同時に高精度に解析する独自の手法をEnIGMA (Enzyme-assisted Iden- tification of Genome Modification Assay) 法と名付け、開発を行ってきた。本研究ではこの手法の解析精度を高めた上でゲノムワイド解析にも耐えられるよう改良する。これに加えてこれまでは片鎖ずつしか解析できなかった手法を、DNAの2本鎖を同時に解析が可能になるよう改良を行い、あまり考慮されてこなかった「ヘミ修飾」も含め、シトシン修飾の生物学的意味を明らかにすることを目指している。すでに我々が開発してきたEnIGMA法では哺乳類のDNAメチル化酵素であるDNMT1の持つ基質特異性を用いてmC、hmCおよびCを同時に解析することを可能とした。それぞれのシトシンの修飾状態に対してその解析精度は95%程度と他のhmC解析技術と同程度の精度で修飾状態を同定できることが示されている。初年度においてはmC、hmCを持つ合成DNAをモデル基質として作成し、新たに考案した酵素反応の組み合わせによってmC、hmCおよびCの同定が可能であることを確認した。また、種々の反応条件の至適化を開始し、十分に高い精度での解析が可能となるよう実験条件の設定を試みるとともに、実際にマウスのゲノムを用いても同様に解析が可能であるか、EnIGMAver.1とver.2とを比較しながら検討を開始した。２年度目はさらに改良を加えて両鎖の修飾状態を同時に解析する手法の開発を開始した。

We have developed the EnIGMA (Enzyme-assisted Iden-tification of Genome Modification Assay) method for simultaneous and high-precision analysis of mC and non-modified sittings (C). This study aims to improve the analytical accuracy of the method. This is the first time that the DNA has been analyzed and the biological meaning of the modification has been clarified. The EnIGMA method was developed to analyze mammalian DNA enzymes simultaneously using mC, hmC and C. The analytical accuracy of the modified state of the system is 95%, and the analytical accuracy of the hmC is the same. In the early years, the synthesis of mC, hmC and C was carried out. The synthesis of mC, hmC and C was confirmed. The analysis of the optimal conditions for the species is possible, very accurate, and the conditions for the species are set to be used. The analysis of the same species is possible, and the comparison is possible. 2. To improve the quality of the product