Development of analytical method for DNA hydroxymethylcytosine and biological significance of hemi-modification of cytosine.

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我々はメチルシトシン(mC)の脱メチル化反応に関わることが明らかになったヒドロキシメチルシトシン(hmC)を、mCや非修飾のシトシン(C)と同時に高精度に解析する独自の手法をEnIGMA (Enzyme-assisted Iden- tification of Genome Modification Assay) 法と名付け、開発を行ってきた。本研究ではこの手法の解析精度を高めた上でゲノムワイド解析にも耐えられるよう改良する。これに加えてこれまでは片鎖ずつしか解析できなかった手法を、DNAの2本鎖を同時に解析が可能になるよう改良を行い、あまり考慮されてこなかった「ヘミ修飾」も含め、シトシン修飾の生物学的意味を明らかにすることを目指している。すでに我々が開発してきたEnIGMA法では哺乳類のDNAメチル化酵素であるDNMT1の持つ基質特異性を用いてmC、hmCおよびCを同時に解析することを可能とした。それぞれのシトシンの修飾状態に対してその解析精度は95%程度と他のhmC解析技術と同程度の精度で修飾状態を同定できることが示されている。初年度においてはmC、hmCを持つ合成DNAをモデル基質として作成し、新たに考案した酵素反応の組み合わせによってmC、hmCおよびCの同定が可能であることを確認した。また、種々の反応条件の至適化を開始し、十分に高い精度での解析が可能となるよう実験条件の設定を試みるとともに、実際にマウスのゲノムを用いても同様に解析が可能であるか、EnIGMAver.1とver.2とを比較しながら検討を開始した。２年度目はさらに改良を加えて両鎖の修飾状態を同時に解析する手法の開発を開始した。