等温PCRを用いた修飾塩基測定法の開発と在宅がん診断への展開

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本研究では等温PCRを用いて標的遺伝子中の修飾塩基を簡便に測定する方法を開発することを目的としている。これまでに血管内皮増殖因子（VEGF）プロモーター中に含まれるグアニン四重鎖(G4)構造と、その相補鎖で形成されるintercalated motif (i-motif)構造中のCpG配列中のシトシンがメチル化されると、これら構造の熱安定性が上昇することを示した。また、これらの領域がメチル化されていると、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅効率が低下することも報告している。そこで、本年度は等温PCR法であるRecombinase Polymerase Amplification（RPA）法を用いて、VEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベルを検出できるか検討した。まず、HeLaヒトゲノムDNAからVEGFプロモーター領域をPCRで増幅し、CpGメチル化酵素でメチル化したPCR産物を得た。メチル化PCR産物と非メチル化PCR産物を混合し、メチル化レベルの異なる鋳型DNAを調製した。これらを鋳型にRPAを行い、RPAの増幅効率が鋳型DNAのCpGメチル化レベルに依存して減少するか検討した。その結果、鋳型DNAのCpGメチル化レベルに依存してRPA効率が減少することが示された。次に、ヒトゲノムDNA中のVEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベルをRPAの増幅効率を指標に測定できるか検討した。その結果、RPA増幅効率はゲノムDNA中のVEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベル依存的に減少することが示された。つまり、RPAの増幅効率を測定するだけで、30分以内に標的領域のCpGメチル化レベルを測定できることが示された。