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電気信号を化学信号に変える電位依存性ホスファターゼVSPの動作機構の解明

阐明电压依赖性磷酸酶 VSP 将电信号转化为化学信号的操作机制

基本信息

批准号：
21H02444
负责人：
中川敦史
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

電位依存性ホスファターゼVSPは、膜電位という電気信号を酵素活性の制御という化学信号に変える膜タンパク質であり、生物における電気信号の新たな役割を示す重要な分子である。本研究では、VSPの様々な状態の詳細な原子構造を解明し、VSPが電気信号を化学信号に変える動作機構の理解を目指すとともに、電気生理実験や蛍光アミノ酸ANAPを利用した実験により、細胞内の動きを追うことを試みた。この目的を達成するために、従来の研究で静止状態が安定化していることが知られている野生型VSPを対象として発現・精製条件の決定を進めた。様々な界面活性剤をスクリーニングした結果、動的光散乱（DLS）で単分散を示し、ゲルろ過、SDS-PAGEで結晶化に供すことのできる純度であることが確認できる試料調製条件を決定することができた。さらに、ホヤ由来VSP（Ci-VSP）について、電気生理学、蛍光測定、構造モデリングを組み合わせたアプローチにより、膜電位変化が酵素活性に与える影響について調べた。その結果、S4の最下流にある2つの疎水性残基が、電位センサードメイン（VSD）と細胞質酵素領域（CCR）のカップリングに重要な役割を果たすことを見いだした。また、Voltage Clamp Fluorometry（VCF）とジスルフィド結合実験により、S4とその隣のリンカーが1本のヘリックス（S4-linker helix）として動き、CCRのhydrophobic spinと呼ばれる領域に近づくことが示された。このhydrophobic spineは、VSPにおいて電気信号を化学信号に変換するためのハブとして機能していると考えられる。また、これまでに構造が得られているVSPと各種基質複合体の構造を基にして、PTENの基質認識機構についてのを明らかにすることを目指した分子動力学計算を進めた。

Potential-dependent VSP, membrane potential, electrical signal, enzyme activity control, chemical signal, membrane quality control, biological electrical signal, new enzyme activity control, important molecule control. This study aims to clarify the detailed atomic structure of VSP and the mechanism of VSP and chemical signals, and to explore the mechanism of VSP and chemical signals. To achieve this goal, we will study the static state, stabilize it, and determine the conditions for the development of wild-type VSP. Determination of sample preparation conditions for the determination of interfacial activity, dispersion, purity, and SDS-PAGE crystallization In addition, the origin of VSP (Ci-VSP), electrophysiology, fluorescence measurement, structure, and combination of enzyme activity, membrane potential change, and enzyme regulation. As a result, S4 is the most important component of the enzyme domain (CCR). Voltage Clamp Fluorometry (VCF) is used to determine the connection between the two components. S4 is used to determine the connection between the two components. S4 is used to determine the connection between the two components. S4 is used to determine the connection between the two components. This is the first time I've ever seen a hydrophobic spine The structure of PTEN matrix complex was studied by molecular dynamics.