ATPチャネルPannexinファミリーの構造機能解析

ATP通道Pannexin家族的结构-功能分析

• 批准号: 22KJ0577
• 负责人: 田中 達基
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0577/
• 关键词: クライオ電子顕微鏡; ATPチャネル; 骨形成; アポトーシス; ギャップジャンクション; イオンチャネル

Pannexin3に関して、哺乳細胞を用いた大量発現・Hisタグアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いた精製に成功し、撮影試料を作製したのち200kVクライオ電子顕微鏡Talos arkticaを用いたデータ測定、解析ソフトRelionによるデータ解析によって膜貫通領域及び細胞内領域が明瞭に確認できる良好な二次元平均像が得られたことを以前に報告した。当該データセットを用いてさらに解析を進めたが、解析に用いることのできる状態の良い粒子の少なさから明瞭な三次元マップは得られなかった。そこでより多くのデータを取得するため撮影試料の再現を試みたが、Hisタグアフィニティー精製及びTEVプロテアーゼによるタグの切断が安定しないという問題から撮影試料作製には至らなかった。今年度はコンストラクトや発現ホストを再検討し、引き続き撮影試料の再現を目指す。またGFP-nanobodyを用いた精製法など精製プロトコルに関しても再検討し、より高純度かつ均一性の高い撮影試料を作製する。

Pannexin3 に masato し て, mammalian cell を い た large 発 now, ihs タ グ ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー and び ゲ ル ろ too ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い た refined に し success, pinch of shadow sample を cropping し た の ち 200 kv ク ラ イ オ Talos electronic 顕 micro mirror Arktica を with い た デ ー タ determination, parsing ソ フ ト Relion に よ る デ ー タ parsing に よ っ て transmembrane domain and び cell が clear に confirm で き る good な secondary yuan on average as が ら れ た こ と を に report before し た. When the デ ー タ セ ッ ト を with い て さ ら に parsing を into め た が, analytical に い る こ と の で き る state less good の い particle の な さ か ら clear three dimensional な マ ッ プ は have ら れ な か っ た. そ こ で よ り more く の デ ー タ を obtain す る た め pinch of shadow sample の reappearance を try み た が, ihs タ グ ア フ ィ ニ テ ィ ー refinement and び TEV プ ロ テ ア ー ゼ に よ る タ グ の cut が settle し な い と い う problem か ら pinch of shadow sample for making に は to ら な か っ た. This year, コ コ ストラ ストラ トや トや トや have reappeared ホストを and 検 discussed 続, and <s:1> 続 and 続 have reappeared を. ま た GFP - nanobody を with い た refining process な ど refined プ ロ ト コ ル に masato し て も again beg し 検, よ り high-purity か つ high uniformity の い pinch of shadow sample を cropping す る.