ATPチャネルPannexinファミリーの構造機能解析

Pannexin3に関して、哺乳細胞を用いた大量発現・Hisタグアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いた精製に成功し、撮影試料を作製したのち200kVクライオ電子顕微鏡Talos arkticaを用いたデータ測定、解析ソフトRelionによるデータ解析によって膜貫通領域及び細胞内領域が明瞭に確認できる良好な二次元平均像が得られたことを以前に報告した。当該データセットを用いてさらに解析を進めたが、解析に用いることのできる状態の良い粒子の少なさから明瞭な三次元マップは得られなかった。そこでより多くのデータを取得するため撮影試料の再現を試みたが、Hisタグアフィニティー精製及びTEVプロテアーゼによるタグの切断が安定しないという問題から撮影試料作製には至らなかった。今年度はコンストラクトや発現ホストを再検討し、引き続き撮影試料の再現を目指す。またGFP-nanobodyを用いた精製法など精製プロトコルに関しても再検討し、より高純度かつ均一性の高い撮影試料を作製する。

Pannexin3に関して、哺乳細胞を用いた大量発現・Hisタグアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いた精製に成功し、撮影試料を作製したのち200kVクライオ電子顕微鏡Talos arkticaを用いたデータ測定、解析ソフトRelionによるデータ解析によって膜貫通領域及び細胞内領域が明瞭に確認できる良好な二次元平均像が得られたことを以前に報告した。当該データセットを用いてさらに解析を進めたが、解析に用いることのできる状態の良い粒子の少なさから明瞭な三次元マップは得られなかった。そこでより多くのデータを取得するため撮影試料の再現を試みたが、Hisタグアフィニティー精製及びTEVプロテアーゼによるタグの切断が安定しないという問題から撮影試料作製には至らなかった。今年度はコンストラクトや発現ホストを再検討し、引き続き撮影試料の再現を目指す。またGFP-nanobodyを用いた精製法など精製プロトコルに関しても再検討し、より高純度かつ均一性の高い撮影試料を作製する。