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Dynamic Structural Analysis of Protein Translocation Across Membrane by Cryo-EM

利用冷冻电镜对蛋白质跨膜易位进行动态结构分析

基本信息

批准号：
21H02452
负责人：
津下英明
金额：
$ 8.32万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ウェルシュ菌が持つbinary毒素である、膜孔形成毒素Ibの構造と機能解析を進めている。膜孔形成毒素Ibはアクチン特異的ADPリボシル化する酵素Iaを膜透過させるトランスロコンである。IaがアクチンのADPリボシル化毒性を発揮するためにはIbが①水溶性プレ膜孔オリゴマー(7量体）を形成、次に細胞膜上で構造変化をおこし②Ibオリゴマーからなる膜孔を形成、③これにIaが結合し、Iaの立体構造がほどけて、④IaがIbオリゴマー膜孔を通過する、この４つのステップが必要となる。我々はクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により、Ib膜孔とIaが結合したIb膜孔の構造をそれぞれ2.9オングストローム;の分解能で決定することに成功している(2020年）。これに続いて、抗生物質耐性菌の感染が問題となっているディフィシル菌が持つ二成分毒素CDTの構造をクライオ電子顕微鏡を用いて明らかにした（Nature Communications, 2022)。界面活性剤LMNGの存在下で、CDTa結合したCDTb膜孔を調製、電子顕微鏡でのデータ測定と解析を進めた。その結果、ダイヘプタマーの14量体とともにイオタ毒素と同様の７量体のCDTb膜孔構造が存在していることがわかった。これにCDTaを加えて、クライオ電子顕微鏡での構造決定を行った。其の結果CDTa１分子がCDTb膜孔に結合した構造を明らかにした。さらに、CDTaがCDTb膜孔に結合した状態での構造解析から、結合したばかりのCDTaとCDTb膜孔複合体と、CDTaのN末端のαヘリックスが一部解けた状態とCDTb膜孔複合体の２つの構造をそれぞれ精密化して明らかにした。これはN末端のαヘリックスのアンフォールディングの動的な様子を捉えた初めての報告となった。

Youdaoplaceholder0 シュシュ bacteria が hold <s:1> binary toxins である, membrane pores form toxins Ib <s:1> structure と function analysis を enter めてめてるるる. The membrane pore forms toxin Ib アアチチチ specific ADPリボシする enzyme Iaを membrane permeates させるトラ <e:1> スロコであるである. Ia がアクチンの ADP リボシル chemical toxicity を発 swing するためには Ib が (1) water soluble プレ film hole オリゴマー amount (7) をで structural variations on the に cell membrane formation, times change をおこし (2) the Ib オリゴマーからなる film hole を formation, (3) これに Ia がし, Ia の three-dimensional structure がほどけて, (4) Ia が Ib オリゴマー The membrane pores を pass through する, <s:1> する 4 するステップがステップがステップが necessary となる. I 々はクライオ electronic 顕 micromirror を with いた単 particle analytical により, Ib film hole と Ia が combining した Ib film hole の tectonic をそれぞれ 2.9 オングストローム; The ability to decompose で determines するとにとに success <s:1> てるるるる(2020). これに続いて, antibiotic resistant bacterium の infection が problems となっているディフィシルが hold つ two component toxins CDT の tectonic をクライオ electronic 顕 micromirror を with いて Ming らかにした (Nature Communications, 2022). で, in the presence of surface active tonic LMNG の CDTa combining した CDTb film hole を modulation, electronic 顕 micromirror でのデータ determination と parsing を into めた. その results, ダイヘプタマーの 14 quantity body とともにイオとタ toxin with others の 7 quantity body の CDTb film hole structure exist がしていることがわかった. The structure of the でれにCDTaを plus えて and the でラ <s:1> <s:1> <s:1> 顕 electronic 顕 micromirror で determines the を row った. The result is that the CDTa1 molecule がCDTb membrane pores に bind to the <s:1> た structure を, らににたた. さらに, CDTa が CDTb film hole に combining した state での structure から, combined したばかりの CDTa と CDTb composite film hole と, CDTa の N terminal の alpha ヘリックスが a solution けた state と CDTb composite film hole の 2 つの tectonic をそれぞれ motors して Ming らかにした. これは N terminal の alpha ヘリックスのアンフォールディングの moving な others child えを caught early ためての report となった.