リン脂質平面膜法によるタンパク質膜透過機構の解析

大腸菌細胞膜におけるタンパク質膜透過に関するSecA,Y,Eなどの因子がどのような機構で膜透過反応を進行させているか、それが単純な孔(チャンネル)を構成しているのかイオンポンプであるのか、また、新たに精製された因子SecGがどのような役割を果たしているか、などを明らかにすることを目的に行われた。まずasolectinによって作製したリン脂質平面膜のcis側に400mMKClを添加することによって浸透圧差をつけ、SecY/E大量発現株の細胞膜をオクチルグルコシドで可溶化した標品あるいは精製した各因子を直接挿入法でcis側から再構成する。単一チャンネルが組み込まれたことを確認した後、潅流により浸透圧差を解消しtrans側の電位を変化させてチャンネルの挙動を調べた。この状態ではチャンネルは常時開口しているが、流れる電流は+電位の方が-電位より大きくゆるい整流性が見られる。また、cis側に種々の塩を加えることによって電流/電圧特性を調べたところ、このチャンネルはNa^+あるいはK^+などの陽イオンは透過させるが、Choline^+やTris^+などの有機陽イオンは透過させないことが示された。また、新しい因子SecGはこのSecY/Eチャンネルのコンダクタンスを約1.5倍上昇させることからSecGはSecY/Eの孔径を大きくすることが考えられる。このようなSecY/Eチャンネルにcis側からSecAおよびSecB+前駆体タンパク質proOmpAを加えると閉口する頻度が上昇し、さらにATPの添加によりチャンネルは完全に閉口した。これらからSecY/E/Gはチャンネル様の挙動を示し、SecAがその開閉を制御し、基質前駆体タンパク質はSecAによるATP水解に伴ってチャンネル内部に挿入されていくことが考えられる。

大腸菌細胞膜におけるタンパク質膜透過に関するSecA,Y,Eなどの因子がどのような機構で膜透過反応を進行させているか、それが単純な孔(チャンネル)を構成しているのかイオンポンプであるのか、また、新たに精製された因子SecGがどのような役割を果たしているか、などを明らかにすることを目的に行われた。まずasolectinによって作製したリン脂質平面膜のcis側に400mMKClを添加することによって浸透圧差をつけ、SecY/E大量発現株の細胞膜をオクチルグルコシドで可溶化した標品あるいは精製した各因子を直接挿入法でcis側から再構成する。単一チャンネルが組み込まれたことを確認した後、潅流により浸透圧差を解消しtrans側の電位を変化させてチャンネルの挙動を調べた。この状態ではチャンネルは常時開口しているが、流れる電流は+電位の方が-電位より大きくゆるい整流性が見られる。また、cis側に種々の塩を加えることによって電流/電圧特性を調べたところ、このチャンネルはNa^+あるいはK^+などの陽イオンは透過させるが、Choline^+やTris^+などの有機陽イオンは透過させないことが示された。また、新しい因子SecGはこのSecY/Eチャンネルのコンダクタンスを約1.5倍上昇させることからSecGはSecY/Eの孔径を大きくすることが考えられる。このようなSecY/Eチャンネルにcis側からSecAおよびSecB+前駆体タンパク質proOmpAを加えると閉口する頻度が上昇し、さらにATPの添加によりチャンネルは完全に閉口した。これらからSecY/E/Gはチャンネル様の挙動を示し、SecAがその開閉を制御し、基質前駆体タンパク質はSecAによるATP水解に伴ってチャンネル内部に挿入されていくことが考えられる。