神経血管ネットワークを有するヒトiPS細胞由来高次肝組織の生体内での再構築

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胆管、血管、神経が伴走して走行する門脈域を構築させるために、2021年度同様、ヒトiPS細胞由来の肝前駆細胞(hiPS-HE)、血管内皮細胞(hiPS-EC)、間葉系幹細胞(hiPS-STM)からなる多数の微小肝芽を神経幹細胞(hiPS-NCC)を3次元培養して得られた神経線維の上に添加し共培養した。2022年度はhiPS-NCCの誘導法を改良したことにより、より安定した実験結果を出すことに成功した。また、十分に神経線維を構築させるために、肝芽を追加するまでのhiPS-NCC単独の培養時間を10日から20日に延長した。hiPS-NCCにはGFPをhiPS-ECにはKO(Kusabira orange)を導入して可視化できるようにし、共培養した肝芽を蛍光顕微鏡でタイムラプス観察を行った。その結果、肝芽の共培養開始後、1から7日にかけて神経突起が肝芽に向かって伸びる様子が観察された。共培養7日目では、肝芽内で構築された血管の周りに神経線維が伴走している様子が観察された。また、CK19の免疫染色を行い肝芽における胆管の観察したところ、肝芽から胆管様に伸びた突起の周りに神経がまとわりついているように観察された。この形態は正常肝の門脈域の形態に近いものと考えられた。また、微小肝芽と肝芽の間に胆管構造の繋がりも観察された。神経を加えない群とで肝芽内の血管、胆管構造を、画像解析ソフトウエアを用いて定量解析し比較検討した。その結果、神経を加えない群では血管の総長、分岐数は有意に低下していた。胆管様の突起数も有意に短かった。また、培養上清中のアルブミン、フィブリノーゲン量をELISAにて測定すると神経の共培養を行なっていない群では有意に少なかった。また、アンモニアクリアランスも有意に低かった。