Understanding of the musculoskeletal system regulated by the transcription factor Scleraxis

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Scx遺伝子の下流に同定した1.97 kbのenhancer領域を、さらに分割し、ゲノム領域をhsp68のminimal promoterとTol2配列を有するLacZ reporterベクターに組み込んたベクターを受精卵にmicroinjectionし、得られたTgマウス胚のLacZ活性をX-gal染色によって解析した。その結果、343 bpのゲノム断片にenhancer活性が検出され、哺乳類、鳥類、シーラカンスまで高度に保存されているモチーフが存在することを見出した。このゲノム領域をpGL4.23に組み込み、enhancer領域に結合する候補となる転写因子の発現ベクターと共に、HEK293T細胞、ATDC5細胞、腱細胞に導入し、Dual luciferase assayを行った。また、昨年度に引き続き、enChIPによる解析も進めている。系譜解析では、ScxCre/+:RosaTomatoマウスを用いた解析によって、２週齢の脛骨では、Scxの発現履歴がある細胞は、付着している腱や靱帯に限局しているが、６週齢になると、皮質骨や一次海綿骨の一部の骨芽細胞でも観察されることを見出している。免疫染色を行うと、それらの細胞では、Runx2の発現が検出された。ScxCreERT2;RosaTomatoマウスに、肋骨でのScxの発現が検出される胎生11.5日より後に4-ヒドロキシタモキシフェンを投与して、Tomatoの発現を観察したところ、肋骨でのCreの発現を回避することが出来ることが確認出来た。Sox9CreERT2;RosaTomatoマウスでの解析では、生後、Sox9の発現する細胞が骨格筋でも検出された。Sox9発現領域でScxを欠失するSox9Cre;Scxflox/floxマウスと野生型マウスの顎関節、腱の付着部、頭蓋の縫合部の形態・組織学的変化を解析している。