超精密個別化ゲノム解析法の開発による遺伝性疾患の病因病態解明

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本年度も、ロングリード（長鎖）シークエンサーを用いて、高精度のヒトハプロイドゲノムを構築することを目的とし、２倍体ゲノムからの高分子DNAの抽出と解析を進めた。抽出法としてNanobindとpromega wizard kitを比較検討した。Nanobindでは、最頻値50kb強、平均40kbのDNAが約23ug、promegaでは、最頻値50kb弱、平均25kbのDNAが約10ug抽出され、Nanobindの方が、サイズ・収量ともに、良好な結果であった。Nanobindで抽出したDNA約7ugを使用してライブラリを作製し、Oxford Nanopore PromethIONを用いて、シークエンスを実施した。ライブラリ1は、総塩基数26.7Gb、リード数1.4M、N50=32.0kb、平均リード長18.8kb、ライブラリ2は、総塩基数41.1Gb、リード数5M、N50=16.6kb、平均リード長8.3kbであった。これらのシークエンスデータを用いてアセンブリーを実施し、コンティグN50=27.3Mb、最大値126.3Mb、平均4.1Mb、総塩基長が2.75Gbを得たことから、十分な質のDNAからシークエンスデータが得られていることが推察される。平均リード長が抽出したDNA断片長から期待される値よりも短い傾向があることから、NEB Monarch HMW DNA Extraction KitによるDNA抽出や、Ultra-Long DNA Sequencing Kit V14+R10.4 poreによるシークエンスの実施など、更なる検討を進める。日本人参照配列の高次元化に利用する全ゲノム情報については、解析が完了している3,000検体を約10,000検体まで拡充し、参照配列の構築に必要なゲノム上の構造変異情報の収集に努める。