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新規スクリーニング法を用いた骨細胞特異的なメカニカルストレス受容体の同定

使用新的筛选方法鉴定骨细胞特异性机械应力受体

基本信息

批准号：
19K18452
负责人：
佐々木文之
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

骨が運動などのメカニカルストレスの負荷により堅牢さを保っていることを、我々は経験的に理解しているが、その分子機序については不明な点が多い。本計画では、独自に構築した骨細胞特異的なメカニカルストレス応答遺伝子、スクレロスチン（遺伝子名: Sost）を指標とした高感度スクリーニング法を用いて、骨細胞特異的に発現している新規メカニカルストレス受容体の同定を試みることを目的とした。CRISPR/Cas9法を用いて、骨細胞株IDG-SW3のSostの翻訳領域に、蛍光タンパク質DsRed-Express2あるいは発光酵素ルシフェラーゼの一種であるNanoLucの部分的な遺伝子配列（タンパク質名: HiBiT）を挿入した２種類のレポーター骨細胞株の樹立を行った。前者のSost-DsRed-Express2ノックインレポーター細胞株を１次スクリーニング、後者のSost-HiBiノックイン細胞株を２次スクリーニングで使用することを計画し、まずPool型shRNAライブラリーを用いて前者の細胞株に遺伝子導入し、１次スクリーニングを実施しているところである。また本研究の実施過程において、骨細胞に発現しているメカニカルストレス感受性イオンチャンネルPiezo1が、Aktシグナル経路を介してSostの発現抑制に寄与していることをin vitroの解析にて明らかにすることができた（Sasakiら, BBRC, 2020）。本研究成果と同時期にin vivo解析において、骨芽細胞-骨細胞系に発現しているPiezo1が骨形成に必須であることが報告された（Liら, eLife, 2019）。これらの結果から、Piezo1は骨細胞におけるメカノセンサーの一つであることが明らかとなった。

In addition, the molecular mechanism of bone movement is not clear. This project aims to construct a new bone cell-specific receptor identification method for bone cell-specific development. CRISPR/Cas9 method was used in the establishment of bone cell lines IDG-SW3 and DsRed-Express2. The gene alignment of part of NanoLuc was introduced into the establishment of two kinds of bone cell lines. The former Sost-DsRed-Express cell line is used once, and the latter Sost-HiBi cell line is used twice. In the implementation of this study, the development of bone cells and the sensitivity of bone cells were investigated. Piezo1, Akt 1 and Akt 1 were involved in the development inhibition of bone cells and in vitro analysis (Sasaki, BBRC, 2020). The results of this study were reported in vivo analysis and development of bone bud cell-bone cell line (Li, eLife, 2019) The result of this is that Piezo1 is a cell of bone, and it is a cell of bone.