アメーバ共生系を基盤とする新規微生物の探索

これまでの研究により単離した候補微生物約150のうち巨大ウイルスを含む巨大核質DNAウイルス(NCLDV)に分類される20種については、ミミウイルス科新規クレードと、新規パンドラウイルス１種について完全ゲノムの決定を目指して研究を進めているが、技術的困難により進捗が遅れていた。このうちDNA精製における問題については、植物細胞からのゲノムDNA単利法で用いられる方法が改変・利用することにより目処をつけることができた。パンドラウイルスからのDNA単離については、ウイルスを溶解するステップに問題があったが、尿素・SDS・プロテアーゼKを主剤とする溶解バッファーにより溶解した後、通常のカラムベースの精製法により高品質な高分子ゲノムDNAを分離することができた。一方で、ミミウイルス科新規クレードウイルスからのゲノムDNA単離は、高塩濃度あるいはアルコール存在下で沈殿を引き起こす夾雑物の存在により、上述の方法では収率が大きく損なわれる問題が残っていたが、高塩濃度下でCTABを作用させることにより高品質な高分子ゲノムDNAを分離するに成功した。またこのように単離したゲノムDNAを利用してONT MinIONによるロングリードを得ることができた。低品質のゲノムDNAを利用して得ていたIlluminaショートリードと合わせてゲノム解析を行ったところ、ミミウイルス科新規クレードウイルスのショートリードの品質に問題があり、再シーケンスする必要があることが判明した。

これまでの研究により単離した候補微生物約150のうち巨大ウイルスを含む巨大核質DNAウイルス(NCLDV)に分類される20種については、ミミウイルス科新規クレードと、新規パンドラウイルス１種について完全ゲノムの決定を目指して研究を進めているが、技術的困難により進捗が遅れていた。このうちDNA精製における問題については、植物細胞からのゲノムDNA単利法で用いられる方法が改変・利用することにより目処をつけることができた。パンドラウイルスからのDNA単離については、ウイルスを溶解するステップに問題があったが、尿素・SDS・プロテアーゼKを主剤とする溶解バッファーにより溶解した後、通常のカラムベースの精製法により高品質な高分子ゲノムDNAを分離することができた。一方で、ミミウイルス科新規クレードウイルスからのゲノムDNA単離は、高塩濃度あるいはアルコール存在下で沈殿を引き起こす夾雑物の存在により、上述の方法では収率が大きく損なわれる問題が残っていたが、高塩濃度下でCTABを作用させることにより高品質な高分子ゲノムDNAを分離するに成功した。またこのように単離したゲノムDNAを利用してONT MinIONによるロングリードを得ることができた。低品質のゲノムDNAを利用して得ていたIlluminaショートリードと合わせてゲノム解析を行ったところ、ミミウイルス科新規クレードウイルスのショートリードの品質に問題があり、再シーケンスする必要があることが判明した。