タンパク質フットプリント法による転写複合体の解析

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本研究では、タンパク質の構造変化・相互作用を解析するためのタンパク質フットプリント法を確立し、それを利用して大腸菌のRNAポリメラーゼの構造・相互作用を検証した。方法としては、(1)目的のタンパク質を含む複合体を限定切断し、(2)ゲル電気泳動で分画し、(3)C末端を含む断片を視覚化した。視覚化のために、RNAポリメラーゼのσサブユニットのC末端にProtein kinase catalytic subunit(Bovine Heart)でリン酸化されるSARRASVAというアミノ酸8残基からなるタグ配列を付加し、大腸菌内で大量発現させ、精製した。タグ配列は遺伝子工学的に付加し、その目的で備品として購入したジーンパルサーを利用した。タグ付きサブユニットは酵素的に^<32>Pで標識し、hydroxyl radicalで切断し(1)、SDSゲル電気泳動により分画した(2)。このようにして単独、ホロ酵素、オープン複合体内でのσサブユニットのフットプリントを解析した結果、以下の結果を得た。1.コア酵素との結合により、σの保存された領域1.1、領域1.1と1.2の間の非必須領域、領域2.1から領域3.2までにかけて、という少くとも3箇所がラジカルによる切断から明瞭に保護された。このうち領域2.1および領域3.2はコア酵素との相互作用に関与することが示唆されていたが、それら以外にも相互作用部位そのもの、あるいはコアとの結合によって構造が変化する部位が存在することが示された。2.オープン複合体形成により、領域3.2がさらに保護された。