Analysis of sperm-oocyte membrane fusion regulator in animal fertilization

1) 線虫において受精に関与する細胞膜タンパク質の探索と動態解析線虫 C. elegans の網羅的 RNAi 解析により発現抑制によって不妊となる遺伝子群 Ste (P0が不妊)、Stp (F1が不妊) が報告されているが、個々の解析はほとんど進んでいない。そこで、これらの遺伝子群から精子と卵母細胞の接着、繋留、融合ステップに関与しうる膜タンパク質を抽出し、現在RNAi法により受精のどの段階で異常を示すか等について順次表現型解析を進めている。また、これらの受精関連因子について酵母ツーハイブリッド法により相互作用因子を探索している。2) マウス卵母細胞に発現する細胞膜タンパク質の探索と動態解析マウス卵子は，性ホルモン等を用いた過剰排卵条件下においても～30個／成熟個体程度の細胞数しか得ることができない希少な生体材料であり、また卵を囲む数種類のタンパク質からなる巨大細胞外基質である透明帯がプロテオミクス解析における検出の感度や細胞蛋白質量の算定などを妨げる懸念がある。そこで、マウス未授精卵を構成するタンパク質の全容を知るため、野生型マウスの未受精卵を500個以上取得してタンパク質を多量に含む透明帯を除去した後、徳島大学の小迫英尊教授との共同研究により卵抽出液について網羅的質量分析を行った。その結果、透明帯を除く約1700種の卵構成タンパク質の同定に成功した。次に、この知見を活かし、野生型の未受精卵と受精卵、および受精異常を示す未受精卵についてそれぞれ約350個ずつ調製しプロテオミクス解析を行った。その結果、3000種以上の卵構成タンパク質を同定し、受精前後において増減する膜タンパク質を多数同定した。現在、これらについて順次、蛍光タンパク質を融合したものを卵において発現し、細胞内局在性等について解析を進めている。

1) 線虫において受精に関与する細胞膜タンパク質の探索と動態解析線虫 C. elegans の網羅的 RNAi 解析により発現抑制によって不妊となる遺伝子群 Ste (P0が不妊)、Stp (F1が不妊) が報告されているが、個々の解析はほとんど進んでいない。そこで、これらの遺伝子群から精子と卵母細胞の接着、繋留、融合ステップに関与しうる膜タンパク質を抽出し、現在RNAi法により受精のどの段階で異常を示すか等について順次表現型解析を進めている。また、これらの受精関連因子について酵母ツーハイブリッド法により相互作用因子を探索している。2) マウス卵母細胞に発現する細胞膜タンパク質の探索と動態解析マウス卵子は，性ホルモン等を用いた過剰排卵条件下においても～30個／成熟個体程度の細胞数しか得ることができない希少な生体材料であり、また卵を囲む数種類のタンパク質からなる巨大細胞外基質である透明帯がプロテオミクス解析における検出の感度や細胞蛋白質量の算定などを妨げる懸念がある。そこで、マウス未授精卵を構成するタンパク質の全容を知るため、野生型マウスの未受精卵を500個以上取得してタンパク質を多量に含む透明帯を除去した後、徳島大学の小迫英尊教授との共同研究により卵抽出液について網羅的質量分析を行った。その結果、透明帯を除く約1700種の卵構成タンパク質の同定に成功した。次に、この知見を活かし、野生型の未受精卵と受精卵、および受精異常を示す未受精卵についてそれぞれ約350個ずつ調製しプロテオミクス解析を行った。その結果、3000種以上の卵構成タンパク質を同定し、受精前後において増減する膜タンパク質を多数同定した。現在、これらについて順次、蛍光タンパク質を融合したものを卵において発現し、細胞内局在性等について解析を進めている。