Analysis of sperm-oocyte membrane fusion regulator in animal fertilization

动物受精精卵膜融合调节因子分析

基本信息

批准号：
20H00466
负责人：
佐藤健
金额：
$ 28.7万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H00466/
关键词：
受精卵母細胞精子膜融合エンドサイトーシス

项目摘要

1) 線虫において受精に関与する細胞膜タンパク質の探索と動態解析線虫 C. elegans の網羅的 RNAi 解析により発現抑制によって不妊となる遺伝子群 Ste (P0が不妊)、Stp (F1が不妊) が報告されているが、個々の解析はほとんど進んでいない。そこで、これらの遺伝子群から精子と卵母細胞の接着、繋留、融合ステップに関与しうる膜タンパク質を抽出し、現在RNAi法により受精のどの段階で異常を示すか等について順次表現型解析を進めている。また、これらの受精関連因子について酵母ツーハイブリッド法により相互作用因子を探索している。2) マウス卵母細胞に発現する細胞膜タンパク質の探索と動態解析マウス卵子は，性ホルモン等を用いた過剰排卵条件下においても～30個／成熟個体程度の細胞数しか得ることができない希少な生体材料であり、また卵を囲む数種類のタンパク質からなる巨大細胞外基質である透明帯がプロテオミクス解析における検出の感度や細胞蛋白質量の算定などを妨げる懸念がある。そこで、マウス未授精卵を構成するタンパク質の全容を知るため、野生型マウスの未受精卵を500個以上取得してタンパク質を多量に含む透明帯を除去した後、徳島大学の小迫英尊教授との共同研究により卵抽出液について網羅的質量分析を行った。その結果、透明帯を除く約1700種の卵構成タンパク質の同定に成功した。次に、この知見を活かし、野生型の未受精卵と受精卵、および受精異常を示す未受精卵についてそれぞれ約350個ずつ調製しプロテオミクス解析を行った。その結果、3000種以上の卵構成タンパク質を同定し、受精前後において増減する膜タンパク質を多数同定した。現在、これらについて順次、蛍光タンパク質を融合したものを卵において発現し、細胞内局在性等について解析を進めている。

1）搜索和动态分析细胞膜蛋白参与线虫的受精。秀丽隐杆线虫的综合RNAi分析报告说，基因组Ste（P0是不育症）和STP（F1是不育），这导致由于表达抑制而导致不育症，但是单个分析几乎没有进行。因此，从这些基因组中提取了可以参与精子和卵母细胞的粘附，绑扎和融合步骤的膜蛋白，并且目前使用RNAI方法顺序进行表型分析来确定施肥的哪个阶段，以表现出异常。此外，通过酵母双杂交方法搜索相互作用因子以获取这些与受精相关的因子。 2）在小鼠卵母细胞中表达的细胞膜蛋白的搜索和动态分析是罕见的生物材料，即使在过度排卵条件下使用性激素等，即使在过度排卵条件下，每个成熟个体只能获得约30个细胞，并且担心zona zona pellucidation，是一种巨大的外胞外矩阵，围绕着几种蛋白质的蛋白质，该蛋白质构成了几个蛋白质，该蛋白质构成了围绕着蛋白质，该蛋白质构成了围绕着蛋白质的构成，该蛋白质围绕着蛋白质的互动，分析和细胞蛋白量的计算。因此，为了找出构成小鼠未受精卵的蛋白质的全部含量，获得了超过500个未施用的野生型小鼠的卵，以去除蛋白质富含蛋白质的Zona pellucida，然后与Osako Hidetoshi教授合作进行了蛋提取物的全面质量分析。结果，除了Zona pellucida以外，我们成功地确定了大约1,700个卵高蛋白质蛋白。接下来，使用这一发现，准备了大约350个野生型鸡蛋和未剥皮的鸡蛋，并制备了表现出受精异常的未施用卵并进行了蛋白质组学分析。结果，鉴定了超过3,000个卵高蛋白质，并且在鉴定出受精前后增加或减少的许多膜蛋白被鉴定出来。当前，这些荧光蛋白的融合在一个接一个地表达在鸡蛋中，并且正在为其亚细胞定位进行分析，等等。