組織学と複合した単一細胞DNAメチル化解析法による原始卵胞淘汰過程の解明
利用单细胞 DNA 甲基化分析结合组织学阐明原始卵泡选择过程
基本信息
- 批准号:20H00471
- 负责人:
- 金额:$ 28.45万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
- 财政年份:2020
- 资助国家:日本
- 起止时间:2020-04-01 至 2025-03-31
- 项目状态:未结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
本年度はトランスクリプトーム解析技術をDNAメチル化解析技術(tPBAT)によりよく適応可能なように拡張した。すなわち、DNAメチル化解析と組織解析をより良く統合するためには、アルコール固定だけでなくホルマリン固定された組織に適用できることが望ましい。またホルマリン固定に適応することで、原始卵胞など小さな組織学的構造や、マウス以外の多様な生物由来のサンプルの解析への適用性が向上すると期待される。そこでアルコール固定された凍結切片に対する溶解法(DRaqL法)に加えて、ホルマリンで強く固定された切片(10%, 24hr)から採取した単一細胞を効率よく溶解し、直接cDNA増幅を適用可能な手法を開発した。架橋されたタンパク質からRNAを可溶化するために、DRaqLとプロテアーゼ処理を組み合わせた。ホルマリン固定された組織からの核酸の可溶化にはProteinase Kがよく用いられるが後続の酵素を分解しcDNA合成反応等を阻害してしまう。このためプロテアーゼの不活化が必要であるが、90度10分以上の過熱などの過激な条件か、化学的に架橋する阻害剤が必要である。先行研究に阻害剤を用いたcDNA増幅手法があるが、我々の再現実験では効率のよいcDNA増幅は得られなかった。これは化学的活性のある阻害剤は阻害剤自体の安定性が十分でないために期待される阻害活性を安定して得ることが難しいためであると考えられた。このため、加熱によって失活させることができるプロテアーゼを用いて、再現性の高い結果を得ることができた(DRaqL-Protease法)。卵巣切片に適用すると正しく顆粒層細胞と卵母細胞を区別することができた。さらに卵巣オルガノイドを用いて動的に卵胞形成過程をモニターして切片からの形態-オミクス解析技術を検証する系を立ち上げており、蛍光レポーターを導入する実験系をセットアップしつつある。
This year, the possibilities of using Transkryptonome analysis technology and DNA fusion analysis technology (tPBAT) have been expanded. DNA analysis, tissue analysis, and fixation It is expected that the applicability of the analysis of the origin of various organisms other than protozoa, the structure of protozoa and small tissues will be improved. The DRaqL method for frozen sections was developed using a single cell lysis rate and direct cDNA amplification technique. The bridge is open to RNA solubilization. The bridge is open to RNA solubilization. Protein K is used to inhibit DNA synthesis. The temperature is above 90 ° C and the temperature is above 10 ° C. The chemical bridging agent is necessary. The first step is to study the method of cDNA amplification in order to obtain the correct rate of cDNA amplification The stability of the inhibitor itself is very high. The method of DRaqL-Protease is used to inactivate the protein. Oocyte sections are suitable for use in differentiation between granulosa cells and oocytes. The egg cell formation process of the egg cell in the middle of the egg cell is divided into three parts: the first part is divided into three parts: the second part is divided into three parts: the first part is divided into three parts: the second part is divided into three parts: the third part is divided into four parts: the fourth part is divided into three parts: the fourth part is divided into four parts: the fourth part
项目成果
期刊论文数量(14)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Epigenome reprogramming in the male and female germ line
- DOI:10.1016/b978-0-12-819753-0.00001-5
- 发表时间:2021
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:K. Kurimoto;Hiroki Ikeda;Hisato Kobayashi
- 通讯作者:K. Kurimoto;Hiroki Ikeda;Hisato Kobayashi
Histology-associated transcriptomic heterogeneity in ovarian folliculogenesis revealed by quantitative single-cell RNA-sequencing for tissue sections with DRaqL
- DOI:10.1101/2022.12.14.520513
- 发表时间:2022-12
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Hiroki Ikeda;Shintaro Miyao;So I. Nagaoka;Takuya Yamamoto;K. Kurimoto
- 通讯作者:Hiroki Ikeda;Shintaro Miyao;So I. Nagaoka;Takuya Yamamoto;K. Kurimoto
Quantitative single-cell RNA-sequencing for tissue sections with DRaqL; an efficient RNA recovery and cDNA amplification method for laser capture microdissection
使用 DRaqL 对组织切片进行定量单细胞 RNA 测序;
- DOI:
- 发表时间:2022
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Miyawaki-Kuwakado A;Wu Q;Harada A;Tomimatsu K;Fujii T;Maehara K;Ohkawa Y.;Kazuki Kurimoto
- 通讯作者:Kazuki Kurimoto
始原生殖細胞発生過程におけるDNAメチル化リプログラミング
原始生殖细胞发育过程中的 DNA 甲基化重编程
- DOI:
- 发表时间:2020
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:神鳥和代;藤原祐一郎;栗本一基
- 通讯作者:栗本一基
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栗本 一基其他文献
転写制御因子による生殖細胞系列の試験管内誘導
通过转录调节剂体外诱导种系
- DOI:
- 发表时间:
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斎藤 通紀.
転写制御因子による始原生殖細胞様細胞の誘導とその解析
转录调控因子对原始生殖细胞样细胞的诱导及其分析
- DOI:
- 发表时间:
2012 - 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
中木 文雄(発表者);林 克彦;大田 浩;栗本 一基;薮田 幸宏;斎藤 通紀.;斎藤通紀 - 通讯作者:
斎藤通紀
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$ 28.45万 - 项目类别:
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