mRNAのAU-rich elementに結合するタンパク質AUHの結晶構造解析

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前年度は、AUHタンパク質と6merのRNA AUUUAGを混合して結晶化し、AUHタンパク質の結晶構造を2.2Åで決定した。RNAの電子密度は結晶構造中に見出すことは出来なかった。今年度は、前年度に引き続きAUHとRNAの複合体の結晶化を試みた。まずAUHの標的RNAとして有望な97merのRNA配列(AUUU)_<24>Aを、T7 RNAポリメラーゼを用いて合成し、ゲルシフトアッセイによってAUHとの結合能を調べた。その結果、解離乗数が1μM程度であることが明らかになった。また、AUHと(AUUU)_<24>ARNAの複合体は単一のバンドを形成していたので、均一な複合体を形成していると考えられた。このことから、AUHとRNAの複合体が結晶化に適していると考えられたので結晶化をおこなった。AUHとRNAを混合して蒸気拡散法により結晶化をおこなった。沈殿剤として2M硫酸アンモニウムと2%PEG 400を用いた条件で、再現性良く板状結晶を得ることができた。SPring-8BL44 B2で回折データの収集をおこなった結果、この結晶は空間群P21(a=84.04Å,b=129.17Å,c=89.15Å,β=94.62°)に属することがわかった。この結晶について、前年度に構造解析したAUHタンパク質をサーチモデルとしたAUH分子置換法によって、2.4Å分解能で構造決定した。この結晶構造中では、残念ながらRNAの電子密度を見出すことは出来なかった。しかしながら、この結晶中のAUHたんぱく質の構造は、前年度に解析したAUHタンパク質と比べて、大きな構造変化を起こしていることがわかった。6merのRNAと混合した時のAUHは、2つの3量体の間に2回対称軸をもつ6量体を形成していた。一方で、97merのRNAと混合したAUHも、2つの3量体からなる6量体を形成していたが、会合の仕方が大きくことなっていた。すなわち、2つの3量体の間には2回対称軸は存在しておらず、3量体の2量体化は非対称的であった。その結果、2つの3量体の間に形成される溝の一つが閉じ、反対側に口を開いた構造をとるようになっていた。また、結晶を溶解して7Murea変性PAGEで電気泳動したところ、結晶中にRNAが含まれていることを確認した。これらのことから、97merRNAとの結合によって、短いRNAとの結合では起きなかったような会合状態の変化がAUHに起きていると考えられる。