mRNAのAU-rich elementに結合するタンパク質AUHの結晶構造解析

与 mRNA 富含 AU 元件结合的蛋白质 AUH 的晶体结构分析

• 批准号: 01J05887
• 负责人: 栗本 一基
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J05887/
• 关键词: RNA結合タンパク質; 一本鎖RNA; AU-rich element; X線結晶構造解析; ミトコンドリア; enoyl-CoA hydratase; β酸化; 構造変化

前年度は、AUHタンパク質と6merのRNA AUUUAGを混合して結晶化し、AUHタンパク質の結晶構造を2.2Åで決定した。RNAの電子密度は結晶構造中に見出すことは出来なかった。今年度は、前年度に引き続きAUHとRNAの複合体の結晶化を試みた。まずAUHの標的RNAとして有望な97merのRNA配列(AUUU)_<24>Aを、T7 RNAポリメラーゼを用いて合成し、ゲルシフトアッセイによってAUHとの結合能を調べた。その結果、解離乗数が1μM程度であることが明らかになった。また、AUHと(AUUU)_<24>ARNAの複合体は単一のバンドを形成していたので、均一な複合体を形成していると考えられた。このことから、AUHとRNAの複合体が結晶化に適していると考えられたので結晶化をおこなった。AUHとRNAを混合して蒸気拡散法により結晶化をおこなった。沈殿剤として2M硫酸アンモニウムと2%PEG 400を用いた条件で、再現性良く板状結晶を得ることができた。SPring-8BL44 B2で回折データの収集をおこなった結果、この結晶は空間群P21(a=84.04Å,b=129.17Å,c=89.15Å,β=94.62°)に属することがわかった。この結晶について、前年度に構造解析したAUHタンパク質をサーチモデルとしたAUH分子置換法によって、2.4Å分解能で構造決定した。この結晶構造中では、残念ながらRNAの電子密度を見出すことは出来なかった。しかしながら、この結晶中のAUHたんぱく質の構造は、前年度に解析したAUHタンパク質と比べて、大きな構造変化を起こしていることがわかった。6merのRNAと混合した時のAUHは、2つの3量体の間に2回対称軸をもつ6量体を形成していた。一方で、97merのRNAと混合したAUHも、2つの3量体からなる6量体を形成していたが、会合の仕方が大きくことなっていた。すなわち、2つの3量体の間には2回対称軸は存在しておらず、3量体の2量体化は非対称的であった。その結果、2つの3量体の間に形成される溝の一つが閉じ、反対側に口を開いた構造をとるようになっていた。また、結晶を溶解して7Murea変性PAGEで電気泳動したところ、結晶中にRNAが含まれていることを確認した。これらのことから、97merRNAとの結合によって、短いRNAとの結合では起きなかったような会合状態の変化がAUHに起きていると考えられる。

In the previous year, the crystal structure of AUH 6-mer RNA AUUAG was determined by 2.2%. The electron density of RNA is found in the crystal structure. The crystallization of RNA complexes in this and previous years has been studied. The target RNA of AUH is expected to modulate the binding energy of 97 mer RNA alignment (AUU)_<24>A and T7 RNA. The result is that the number of dissociations is 1μM. AUH (AUUU)_<24>ARNA complex is formed as a single unit, and as a homogeneous complex. The RNA complex is crystallized. AUH RNA is mixed and crystallized. 2M Sulphuric acid is used in the production of plate-like crystals. SPring-8BL44B2 is a crystal space group P21(a=84.04 °,b=129.17 °,c=89.15 °,β=94.62°). The structure analysis of the previous year was carried out by the molecular replacement method, and the structure was determined by the decomposition method. The electron density of RNA in the crystal structure is shown. The structure of the crystal is different from that of the previous year. 6-mer RNA is mixed with 3-mer RNA and 2-mer RNA is mixed with 6-mer RNA. One side, 97mer of RNA mixed together, 2 to 3 molecules formed, and the other side joined together. The two dimensions of the three dimensions are not symmetrical. As a result, the gap between the two volumes is formed, and the gap between the two sides is closed. The DNA in the crystals was dissolved and the DNA in the crystals was confirmed by electrophoresis. 97merRNA binding, short RNA binding, AUH binding