試験管内分子進化と立体構造解析に基づいた赤色蛍光タンパク質の系譜拡張

点击翻译按钮获取中文摘要

前年度に開発したGFP由来RFPであるAzamiRed1.0は4量体であったため、タンパク質のイメージング用タグとしては不適当であると考えられた。そこで、AzamiRed1.0の4量体界面に変異を導入することで単量体化を試みたところ、単量体になった一方で蛍光が完全に失われてしまった。そこでこの単量体化変異体にランダム変異や部位特異的飽和変異導入を繰り返すことで赤色蛍光を回復させた。こうして得られた単量体化RFPであるmARs1を様々なタンパク質と融合させて動物細胞で発現させたところ、想定された細胞内局在を示した。このことから、mARs1はイメージングタグとして十分利用できる性能を有すると考えられた。次に、AzamiRed1.0に導入された29アミノ酸の変異のうち、RFP化に必須なアミノ酸を同定することを試みた。29個の変異を一つ一つもとのアミノ酸に戻した結果、6アミノ酸変異だけ持つタンパク質でもGFP型蛍光団に混じり、僅かにRFP型蛍光団を持つことが示された。AzamiGreenからAzamiRedへの変換で導入した29個のアミノ酸置換によって他のGFPもRFPに変えることができるかを検証した。その結果、AzamiGreenと82%の相同性を有するサンゴ由来GFPであるMcavGFPが変異導入によってRFPに変わることが見いだされた。このことは、上記の29アミノ酸変異はAzamiGreenだけに見られる特殊な変異ではなく、比較的配列の近いGFPをRFPに変えることができる普遍的な変異であることが示唆された。最後に、AzamiGreenおよびAzamiRed1.0の変異体についてX線結晶構造解析を進め、AzamiGreenについては高分解能でのモデルの構築に成功した。