試験管内分子進化と立体構造解析に基づいた赤色蛍光タンパク質の系譜拡張

基于体外分子进化和 3D 结构分析扩展红色荧光蛋白的谱系

• 批准号: 20H03221
• 负责人: 今村 博臣
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03221/
• 关键词: 蛍光タンパク質; 試験管内分子進化; X線結晶構造解析; イメージング

前年度に開発したGFP由来RFPであるAzamiRed1.0は4量体であったため、タンパク質のイメージング用タグとしては不適当であると考えられた。そこで、AzamiRed1.0の4量体界面に変異を導入することで単量体化を試みたところ、単量体になった一方で蛍光が完全に失われてしまった。そこでこの単量体化変異体にランダム変異や部位特異的飽和変異導入を繰り返すことで赤色蛍光を回復させた。こうして得られた単量体化RFPであるmARs1を様々なタンパク質と融合させて動物細胞で発現させたところ、想定された細胞内局在を示した。このことから、mARs1はイメージングタグとして十分利用できる性能を有すると考えられた。次に、AzamiRed1.0に導入された29アミノ酸の変異のうち、RFP化に必須なアミノ酸を同定することを試みた。29個の変異を一つ一つもとのアミノ酸に戻した結果、6アミノ酸変異だけ持つタンパク質でもGFP型蛍光団に混じり、僅かにRFP型蛍光団を持つことが示された。AzamiGreenからAzamiRedへの変換で導入した29個のアミノ酸置換によって他のGFPもRFPに変えることができるかを検証した。その結果、AzamiGreenと82%の相同性を有するサンゴ由来GFPであるMcavGFPが変異導入によってRFPに変わることが見いだされた。このことは、上記の29アミノ酸変異はAzamiGreenだけに見られる特殊な変異ではなく、比較的配列の近いGFPをRFPに変えることができる普遍的な変異であることが示唆された。最後に、AzamiGreenおよびAzamiRed1.0の変異体についてX線結晶構造解析を進め、AzamiGreenについては高分解能でのモデルの構築に成功した。

The previous year's development of GFP was initiated by AzamiRed1.0. AzamiRed1.0 and 4 volume interfaces are different from each other. This is a simple, quantitative, and heterogeneous approach to site-specific saturation. The expression of mARs1 was detected in animal cells and the expression of mARs1 was detected in cells. At this point, mARs1 can take full advantage of its performance in Internet management and networking. Next, AzamiRed1.0 introduced a different set of acid and RFP. 29 different types of fluorescent light, 6 different types of fluorescent light, 6 different types of AzamiGreen, AzamiRed, AzamiGreen, AzamiRed, AzamiGreen, Azami The results showed that AzamiGreen was 82% identical to MavGFP. The difference between the two is that the difference between the two is not obvious. Finally, AzamiGreen and AzamiRed 1.0 have successfully developed X-ray crystal structure analysis with high decomposition energy.

项目成果

緑色蛍光蛋白質由来赤色蛍光蛋白質の開発

由绿色荧光蛋白衍生的红色荧光蛋白的开发

• 发表时间: 2021
• 作者: 今村博臣;大坪史歩;西田水穂;竹川宣宏;今田勝巳
• 通讯作者: 今田勝巳

緑色蛍光蛋白質AzamiGreen由来赤色蛍光蛋白質の結晶構造解析に基づく赤色蛍光団形成の構造基盤

基于绿色荧光蛋白 AzamiGreen 红色荧光蛋白晶体结构分析的红色荧光团形成的结构基础

• 发表时间: 2021
• 作者: 大坪史歩;今村博臣;竹川宣宏;今田勝巳
• 通讯作者: 今田勝巳

Intracellular ATP levels in mouse cortical excitatory neurons varies with sleep-wake states

小鼠皮质兴奋性神经元细胞内 ATP 水平随睡眠-觉醒状态变化

• DOI: 10.1038/s42003-020-01215-6
• 发表时间: 2020
• 期刊: Communications Biology
• 影响因子: 5.9
• 作者: A. Natsubori;T. Tsunematsu;A. Karashima;H. Imamura;N. Kabe;A. Trevisiol;J. Hirrlinger;T. Kodama;T. Sanagi;K. Masamoto;N. Takata;K-A Nave;K. Matsui;K.F. Tanaka;M. Honda
• 通讯作者: M. Honda

緑色蛍光蛋白質AzamiGreen変異体における赤色蛍光発生の構造基盤

绿色荧光蛋白AzamiGreen突变体产生红色荧光的结构基础

• 发表时间: 2021
• 作者: 大坪史歩;竹川宣宏;今村博臣;今田勝巳
• 通讯作者: 今田勝巳

単一細胞ATP濃度イメージングによって明らかとなったアポトーシス細胞内ATP濃度のダイナミクスとその制御

单细胞ATP浓度成像揭示凋亡细胞ATP浓度动态及其调控

• 发表时间: 2021
• 作者: 今村博臣