I分子計測およびX線結晶構造解析による回転分子モーターV_1の回転メカニズムの研究

点击翻译按钮获取中文摘要

V1-ATPaseと同様の回転分子モーターであるF1-ATPaseの活性制御サブユニットがATP結合に伴って構造変化するする性質を利用して,蛍光ATPプローブを作製した.このプローブは制御サブユニットに2つの蛍光団が結合しており,ATPの濃度に応じて2つの蛍光団の間で生じる共鳴エネルギー移動の効率が変化する.作製したプローブは,ATPに対して高い選択性を示し,ADPやGTPといった類似のヌクレオチドにはほとんど反応しなかった.また,εの生物種を変える事で,様々なアフィニティーのプローブが作製できる事が明らかとなった.また,アフィニティーを決定するために重要なアミノ酸残基も同定した.実際に蛍光ATPプローブを培養動物細胞に発現させ,顕微鏡下で細胞の蛍光を観察したところ,通常の培養条件では一定であった蛍光シグナルが,ATP合成阻害剤を加える事で大きく変化する様子が見られた.この事から,作製したATPプローブが実際の生体内のATP濃度をモニターできる事がわかった.この蛍光ATPプローブにシグナル配列を付加する事で,これまで細胞質の他に核,ミトコンドリア,細胞膜にプローブを局在化させる事に成功した.これらを用いて,さまざまなイベントにおける細胞内のATP濃度変化を今後明らかにして行く予定である.また,V1-ATPaseのようなATPを分解もしくは合成する酵素の研究にも用いて行く予定である.