Elucidation of the mechanism of whole eye development and its reproduction in vitro by regulating scaffold environment using pluripotent stem cells

利用多能干细胞调节支架环境阐明全眼发育及其体外繁殖机制

• 批准号: 20H03842
• 负责人: 林 竜平
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03842/
• 关键词: 多能性幹細胞; 眼発生; ECM; インテグリン; 分化; オルガノイド; 角膜; YAP; 涙腺; iPS細胞; 細胞分化

本年度においては、これまでに得たYAP/TAZ経路に関する実験結果に基づき、眼オルガノイド発生に及ぼすYAP/TAZ経路の活性化の影響および3次元オルガノイドモデルの作製実験を実施した。ヒト多能性幹細胞より作製した眼オルガノイドを用いてその初期発生機序におけるYAP/TAZ経路の関与について、YAPの免疫染色や遺伝子発現解析等により調べた。その結果、眼オルガノイドコロニーに中央部の大部分ではYAPは核外に存在し、逆に周辺部では核内に存在していた。またコロニーの中央部、中間、周辺部を機械的に分離し、各領域における遺伝子発現を調べたところ、中央部では神経分化マーカーが、周辺部では上皮系マーカーが強く発現していたことから、YAP経路の活性化と神経・上皮分化の関係性が示唆された。また各領域におけるRNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析により、YAP経路の活性化と相関が見られる既知下流遺伝子を選定し、YAP活性化を標識可能なノックインiPS細胞の樹立を開始した。また3次元オルガノイドモデルとして、ヒトiPS細胞から涙腺様オルガノイドを作製可能であることを示した。免疫染色やタイムラプス顕微鏡観察により、本涙腺様オルガノイド形成においては、まず比較的均質なスフェロイドから外部に細胞が突出し（budding)、導管様構造が形成され、その先端がさらに分岐することにより腺房様細胞に分化すると考えられた。さらにこの形成機構について詳細に調べたとこ、転写因子のBARX2が初期buddingに重要であり、そのノックダウンによりオルガノイド形成は著しく抑制されることが明らかとなった。

This year, we have obtained the results of YAP/TAZ circuit operation, including the effects of basic and secondary development and activation of YAP/TAZ circuit, as well as the implementation of three-dimensional operation. The relationship between YAP/TAZ pathway and YAP immunostaining and gene expression analysis in the early development of pluripotent stem cells was studied. As a result, most of the central part of the eye has YAP outside the nucleus, and the reverse peripheral part has YAP inside the nucleus. The central part, middle part and peripheral part of the tube are mechanically separated, and the gene expression in each field is regulated. The central part of the tube is differentiated, and the peripheral part is inverted. The epithelial system is strongly developed. The activation of the YAP pathway is related to the epithelial differentiation. The analysis of RNA-seq gene expression in various fields, the activation of YAP pathway and the correlation between them, the selection of known downstream genes, the identification of YAP activation, and the establishment of iPS cells began. In addition, it is possible to manufacture three-dimensional oval shaped oval shaped Immunostaining and microscopical examination revealed that there was no differentiation of the glandular cells, and that there was no differentiation of the glandular cells, and that there was no differentiation of the glandular cells. In addition, the formation mechanism of this kind of mechanism is detailed, and the BARX2 of the writing factor is important for the initial budding.

项目成果

眼薬理

眼药理学

• 发表时间: 2021
• 作者: Tsuji Takahiro;Murase Tomoya;Konishi Yoshiyuki;Inatani Masaru;林 竜平
• 通讯作者: 林 竜平

ヒトiPS細胞からの杯細胞を含有する機能的結膜上皮の作製

从人 iPS 细胞中生成含有杯状细胞的功能性结膜上皮

• 发表时间: 2021
• 作者: 能美君人;林 竜平ら
• 通讯作者: 林 竜平ら

多能性幹細胞を用いた眼発生モデルの確立と再生医療への応用

多能干细胞眼发育模型的建立及其在再生医学中的应用

• 发表时间: 2020
• 作者: Igarashi Nozomi;Honjo Megumi;Yamagishi Reiko;Kurano Makoto;Yatomi Yutaka;Igarashi Koji;Kaburaki Toshikatsu;Aihara Makoto;林 竜平
• 通讯作者: 林 竜平

Generation of knockout rabbits with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using CRISPR/Cas9

• DOI: 10.1038/s41598-020-66780-6
• 发表时间: 2020-06-19
• 期刊: SCIENTIFIC REPORTS
• 影响因子: 4.6
• 作者: Hashikawa, Yoshiko;Hayashi, Ryuhei;Nishida, Kohji
• 通讯作者: Nishida, Kohji

大阪大学医学系研究科幹細胞応用医学HP

大阪大学医学研究科干细胞应用医学HP