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選択的スプライシング異常をモデル化・制御可能にするエピゲノム編集技術の開発

开发表观基因组编辑技术，能够建模和控制选择性剪接异常

基本信息

批准号：
20J13292
负责人：
國井厚志
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J13292/
关键词：
転写調節エピゲノム編集 CRISPR-Cas9 因子集積選択的スプライシング

项目摘要

前年度、４種類のＲＮＡ-タンパク質結合システムおよび3種類のタンパク質タグシステムを取り入れ、因子の集積効果を体系的に比較可能なシステム群「ＥＡＲＴＨコレクション」を整備し、転写活性化因子の使用において、一部のシステムがmRNAレベルで従来型を上回ることを見出していた。今年度は、標的遺伝子（ＲＡＮＫＬ、ＣＴＣＦＬ、ＭＭＰ９）のタンパク質レベルでの発現解析（ウェスタンブロット解析および免疫染色）を実施した。細胞株は、前年度に引き続きＨＥＫ２９３Ｔ株とＭＣＦ－７株を使用した。ＲＡＮＫＬ遺伝子およびＣＴＣＦＬ遺伝子の活性化では、ウェスタンブロット解析においてはいずれも目的とするシグナルが検出されなかったものの、免疫染色においては、ＭＣＦ－７株でのＲＡＮＫＬ遺伝子、ＨＥＫ２９３Ｔ株でのＣＴＣＦＬ遺伝子におけるシグナルの増強が確認された。ＭＭＰ９遺伝子の活性化では、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ－７の両株でのウェスタンブロット解析において、システム導入によりシグナルが出現し、システム間での強弱は、ｍＲＮＡレベルでの結果と関連性がみられた。なおＭＭＰ９は、細胞外に分泌後、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を分解する機能を有することから、培養上清からのＭＭＰ９の検出も検討したところ、システム導入によって強いシグナルが出現した。免疫染色でも、特にＭＣＦ－７株ではシステム導入により明瞭なシグナルが出現した。これらの結果から、ＥＡＲＴＨコレクションによって、ｍＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでの発現も誘導されたことが確認された

In the past year, 4 kinds of RNA-protein binding system and 3 kinds of RNA-protein binding system were selected, factors were integrated into the system, and the possibility of gene cluster "EARTH protein" was compared. The use of activation factors was prepared, and a part of RNA-protein binding system and mRNA binding system were analyzed. This year, the detection of target genes (RANKL, CTCFL, MMP 9) was carried out. HEK 293 T strain and MCF-7 strain were used in previous years. The activation of RANKL gene and CTCFL gene was confirmed by immunostaining, and the enhancement of RANKL gene and CTCFL gene in MCF-7 strain and HEK 293T strain was confirmed. MMP9 gene activation, HEK293T, MCF-7 gene expression analysis, gene expression, gene MMP-9 is secreted outside the cell and decomposed outside the cell. MMP-9 is expressed in culture supernatant and introduced into the cell. Immunostaining showed that MCF-7 strains were introduced into the culture medium. The results of this study were as follows: EARTH, mRNA and protein expression.