選択的スプライシング異常をモデル化・制御可能にするエピゲノム編集技術の開発

前年度、４種類のＲＮＡ-タンパク質結合システムおよび3種類のタンパク質タグシステムを取り入れ、因子の集積効果を体系的に比較可能なシステム群「ＥＡＲＴＨコレクション」を整備し、転写活性化因子の使用において、一部のシステムがmRNAレベルで従来型を上回ることを見出していた。今年度は、標的遺伝子（ＲＡＮＫＬ、ＣＴＣＦＬ、ＭＭＰ９）のタンパク質レベルでの発現解析（ウェスタンブロット解析および免疫染色）を実施した。細胞株は、前年度に引き続きＨＥＫ２９３Ｔ株とＭＣＦ－７株を使用した。ＲＡＮＫＬ遺伝子およびＣＴＣＦＬ遺伝子の活性化では、ウェスタンブロット解析においてはいずれも目的とするシグナルが検出されなかったものの、免疫染色においては、ＭＣＦ－７株でのＲＡＮＫＬ遺伝子、ＨＥＫ２９３Ｔ株でのＣＴＣＦＬ遺伝子におけるシグナルの増強が確認された。ＭＭＰ９遺伝子の活性化では、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ－７の両株でのウェスタンブロット解析において、システム導入によりシグナルが出現し、システム間での強弱は、ｍＲＮＡレベルでの結果と関連性がみられた。なおＭＭＰ９は、細胞外に分泌後、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を分解する機能を有することから、培養上清からのＭＭＰ９の検出も検討したところ、システム導入によって強いシグナルが出現した。免疫染色でも、特にＭＣＦ－７株ではシステム導入により明瞭なシグナルが出現した。これらの結果から、ＥＡＲＴＨコレクションによって、ｍＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでの発現も誘導されたことが確認された

前年度、４種類のＲＮＡ-タンパク質結合システムおよび3種類のタンパク質タグシステムを取り入れ、因子の集積効果を体系的に比較可能なシステム群「ＥＡＲＴＨコレクション」を整備し、転写活性化因子の使用において、一部のシステムがmRNAレベルで従来型を上回ることを見出していた。今年度は、標的遺伝子（ＲＡＮＫＬ、ＣＴＣＦＬ、ＭＭＰ９）のタンパク質レベルでの発現解析（ウェスタンブロット解析および免疫染色）を実施した。細胞株は、前年度に引き続きＨＥＫ２９３Ｔ株とＭＣＦ－７株を使用した。ＲＡＮＫＬ遺伝子およびＣＴＣＦＬ遺伝子の活性化では、ウェスタンブロット解析においてはいずれも目的とするシグナルが検出されなかったものの、免疫染色においては、ＭＣＦ－７株でのＲＡＮＫＬ遺伝子、ＨＥＫ２９３Ｔ株でのＣＴＣＦＬ遺伝子におけるシグナルの増強が確認された。ＭＭＰ９遺伝子の活性化では、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ－７の両株でのウェスタンブロット解析において、システム導入によりシグナルが出現し、システム間での強弱は、ｍＲＮＡレベルでの結果と関連性がみられた。なおＭＭＰ９は、細胞外に分泌後、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を分解する機能を有することから、培養上清からのＭＭＰ９の検出も検討したところ、システム導入によって強いシグナルが出現した。免疫染色でも、特にＭＣＦ－７株ではシステム導入により明瞭なシグナルが出現した。これらの結果から、ＥＡＲＴＨコレクションによって、ｍＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでの発現も誘導されたことが確認された