産業微生物の転写因子研究の分子レベルアプローチ

研究工业微生物转录因子的分子水平方法

基本信息

批准号：
20K05802
负责人：
日高將文
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

微生物は生育環境中の栄養源、ストレス源などの濃度変化を感知し、増殖や生存のため遺伝子・タンパク質の発現量を増減させる。そのメカニズムを追求していくと、どのタンパク質が関与しているのか？については分かってくる。では、それらのタンパク質はどのように物質濃度を感知しているのか？その感知した情報をどのように発現レベルにつなげているか？発現制御の分子メカニズムは、いわばブラックボックスとなっているものが多く、微生物の応用を妨げる一因ともなっている。このブラックボックスの解明には、タンパク質分子レベルの研究が不可欠である。本研究は、これまでの微生物学を含む農学研究であまり用いられることがなかった放射光の測定技術を積極的に導入し、分子レベルの微生物の発現制御メカニズム解明にアプローチする。そのための研究ターゲットとして、麹菌の4種の転写因子、AmyR、MalR、CreA、FlbCを選び、機能解析、構造解析を目指す。2022年度はFlbCについて、機能解析、構造解析を目指して大腸菌による発現系の構築を試みた。大腸菌で発現したFlbCは1リットル培養当たり1ミリグラムに満たず、結晶構造解析に供するためには不十分であった。発現条件、精製条件を検討し、特に培地条件を精密化することで、大腸菌1リットル培養当たり5ミリグラムのタンパク質獲得に成功した。精製FlbCはゲルシフト電気泳動解析により、DNAに結合する機能を有していることが確認された。結晶化スクリーニングによって、ポリエチレングリコールを沈殿剤とした結晶を獲得することができており、今後、放射光を利用したX線回折データ測定に供する予定である。

微生物感知到不断增长的环境中养分和应激源的浓度的变化，并增加或减少表达的基因和蛋白质的量，以增殖和生存。当我们追求这种机制时，涉及哪些蛋白质？我会知道的。那么这些蛋白如何感知材料浓度？您如何将检测到的信息连接到其表达水平？可以说，表达控制的许多分子机制都是黑匣子，这就是为什么微生物从微生物的应用中阻碍了微生物的原因之一。蛋白质分子水平的研究对于阐明这个黑匣子至关重要。这项研究积极介绍了测量同步基辐射的技术，这些技术迄今为止在包括微生物学在内的农业研究中尚未使用，并阐明了在分子水平上阐明微生物表达控制机制的方法。为此，我们选择了四种类型的转录因子Amyr，MALR，CREA和FLBC作为研究目标，并旨在分析功能和结构分析。在2022财年，我们尝试使用大肠杆菌进行FLBC构建表达系统，目的是进行功能和结构分析。大肠杆菌中表达的FLBC量小于每升培养的1毫克，这不足以用于晶体结构分析。通过检查表达和纯化条件，尤其是对培养基的改进，我们成功地获得了每1升大肠杆菌培养的5毫克蛋白质。通过凝胶移位电泳分析证实了纯化的FLBC，具有与DNA结合的功能。结晶筛选已使使用聚乙烯乙二醇作为沉淀能够获得晶体，并将用于X射线衍射数据测量，以后使用同步加速器辐射。