Algal regulatory factors involved in maintenance mechanism for cell viabirity cooperating with autophagy

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本研究では、ハイスループットな変異株スクリーニングによる順遺伝学解析系が確立されたモデル緑藻クラミドモナスを活用し、植物界で先駆けて従来型のオートファジー因子とは異なる新奇な細胞生存を制御する分子機構の包括的な解明を目指している。本年は、表現型の緩やかなオートファジー変異体（atg9）への更なる変異導入により選抜されたN・S・Pのいずれの栄養欠乏条件においても生存性が親株よりも早期に低下する変異体21B1変異株の解析を進めた。昨年度までに、この変異体ではタンパク質リン酸化酵素遺伝子21B1に挿入変異を持つことを明らかにしている。野生型との交配により、ATG9への変異と21B1遺伝子の変異を分離した。21B1遺伝子にのみ変異をもつ子孫系統の生存率に関する表現型は、元の21B1変異株と同等であった。このことから、21B1変異株における生存率低下の表現型にはATG9の変異は寄与せず、もっぱら21B1遺伝子への変異によるものであることが示唆された。21B1遺伝子に蛍光タンパク質Venus遺伝子およびFLAGタグを連結したプラスミドを構築し、21B1遺伝子の単独変異体に導入したところ、表現型の回復とともにFLAG抗体を用いたウェスタン解析において予想サイズにシグナルが見られた。このシグナルの強度は栄養欠乏条件の切り替えの前後で変化しなかったことから、21B1タンパク質の発現レベルは栄養欠乏による制御は受けていないことが示唆された。細胞内のVenus由来蛍光パターンの観察により細胞内局在の推定を進めたところ、収縮胞において特異的なシグナルが見られたことから、21B1タンパク質は収縮胞に局在することが示唆された。一方で、リン酸化活性に必須と推定されるリジン残基をメチオニン置換した変異型21B1遺伝子を21B1遺伝子の単独変異体に導入した場合には、変異表現型を相補しない結果を得た。