緑藻クラミドモナスにおけるアグロバクテリウムを用いた遺伝子破壊系の確立

クラミドモナスに対する高感染性アグロバクテリウム株の選定と形質転換条件の最適化クラミドモナス細胞核中の染色体DNAにT-DNAが安定に組み込まれる条件をつきとめるため、以下の諸条件を組み合わせてアグロバクテリウム感染の最適化を試みた。a, 高感染性アグロバクテリウム菌株の選定　単子葉植物や酵母などアグロバクテリウムの宿主範囲外生物の形質転換で使用されている高感染性（supervirulent）菌株を用いて、安定形質転換体が取得できるかを調べ、最も頻度が高く薬剤耐性能を示す菌株を絞り込んだ。b, 感染に最適なクラミドモナス株と細胞ステージの決定　クラミドモナスには細胞壁が厚い系統と薄い系統が存在する。細胞壁の厚さが感染効率に影響するかを細胞壁の厚さの異なる3種類の系統（C9、5D、cw-15）を用いて検証した。しかし、細胞壁の有無は薬剤耐性個体の出現頻度に影響を及ぼさなかった。c, 適切な選抜マーカー遺伝子とアグロバクテリウムの除菌薬剤の選定　クラミドモナスの従来法による形質転換体選抜にはaph7’遺伝子（ハイグロマイシン選抜）、aphVIII 遺伝子（パラモマイシン選抜）、ble遺伝子（ゼオシン選抜）などの選抜システムが使用されている。これらの薬剤選抜系の中でアグロバクテリウム法に適したものを調べるため、各遺伝子発現カセットを既にバイナリーベクターpCAMBIA-1300に組み込み、感染実験に用いた。また、感染後のアグロバクテリウム菌体の除菌に、meropenemやmoxalactamといった新規eta-lactam系抗生物質がクラミドモナスでも効果的であることが示された。

クラミドモナスに対する高感染性アグロバクテリウム株の選定と形質転換条件の最適化クラミドモナス細胞核中の染色体DNAにT-DNAが安定に組み込まれる条件をつきとめるため、以下の諸条件を組み合わせてアグロバクテリウム感染の最適化を試みた。a, 高感染性アグロバクテリウム菌株の選定　単子葉植物や酵母などアグロバクテリウムの宿主範囲外生物の形質転換で使用されている高感染性（supervirulent）菌株を用いて、安定形質転換体が取得できるかを調べ、最も頻度が高く薬剤耐性能を示す菌株を絞り込んだ。b, 感染に最適なクラミドモナス株と細胞ステージの決定　クラミドモナスには細胞壁が厚い系統と薄い系統が存在する。細胞壁の厚さが感染効率に影響するかを細胞壁の厚さの異なる3種類の系統（C9、5D、cw-15）を用いて検証した。しかし、細胞壁の有無は薬剤耐性個体の出現頻度に影響を及ぼさなかった。c, 適切な選抜マーカー遺伝子とアグロバクテリウムの除菌薬剤の選定　クラミドモナスの従来法による形質転換体選抜にはaph7’遺伝子（ハイグロマイシン選抜）、aphVIII 遺伝子（パラモマイシン選抜）、ble遺伝子（ゼオシン選抜）などの選抜システムが使用されている。これらの薬剤選抜系の中でアグロバクテリウム法に適したものを調べるため、各遺伝子発現カセットを既にバイナリーベクターpCAMBIA-1300に組み込み、感染実験に用いた。また、感染後のアグロバクテリウム菌体の除菌に、meropenemやmoxalactamといった新規eta-lactam系抗生物質がクラミドモナスでも効果的であることが示された。