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抗転移細胞で特異的に発現するタンパク質の分子機序解明

阐明抗转移细胞中特异性表达的蛋白质的分子机制

基本信息

批准号：
20K06554
负责人：
富田毅
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトZC3Hタンパク質には58kDaアイソフォームと36kDaアイソフォームの２種類のアイソフォームが存在する。このうち、36kDaアイソフォームは293T細胞での過剰発現系構築および、細胞抽出液からの目的タンパク質精製が比較的容易である。例えば、精製タンパク質を用いたEMSAによる核酸結合アッセイを行うためには、36kDaアイソフォームの場合、10cmディッシュ20枚の293T細胞で可能であるのに対し、58kDaアイソフォームの場合は10cmディッシュ100枚の細胞が必要である。これまでの研究はすべて、36kDaアイソフォームでデータを取得してきた。しかし、実際に生体内で機能しているのは58kDaアイソフォームであるので、ZC3Hタンパク質の機能実験は58kDaアイソフォームで確認しなければならない。ZCタンパク質と結合するタンパク質との相互作用には、58kDaアイソフォーム特異的配列が関与しているとされている。本年度は、58kDaアイソフォームを精製し、IL1bRNAとの結合をEMSAで確認した。さらに蛍光相関分光法(FCS)およびゲルろ過によるタンパク質-RNA結合の検討を行うために58kDaアイソフォームの精製を行っている。精製の第一段階である、タグ抗体カラムによる精製を、これまでに何度か行っているが、精製タンパク質が全く得られないという事象が発生しており、問題となっている。現在、安定的に精製タンパク質を得るためのトラブルシューティングを行っている。ゲルろ過カラムは、高分子の分離に適用できるものがなかったため、新たに導入することとした。

ZC3H protein consists of two kinds of protein: 58kDa protein and 36kDa protein. 36kDa protein was found in 293T cells, which was easy to construct and purify. For example, in the case of 36kDa DNA fusion, 10cm DNA fusion and 20 293T cells are possible, and in the case of 58kDa DNA fusion and 100 cells are necessary. This study was carried out in the presence of a 36kDa protein complex. In vivo, the function of ZC 3H is confirmed to be 58 kDa. ZC protein binding protein interaction, 58kDa protein binding protein specific binding protein interaction This year, 58kDa RNA binding was confirmed by EMSA. In this paper, the purification of 58kDa protein by FCS was studied. The first stage of refinement is to refine, refine Now, the stability of the refined quality of the product is very important. The separation of polymers is a problem.