バイオチップを援用したクルマエビ血球細胞の多項目フェノタイピング

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2019年度は、クルマエビ血球細胞をマイクロ流路にて分類および解析を行うための研究を行った。具体的には細胞のサイズに基づいた分離を行うためのマイクロ流路の開発およびシングルセルmRNA解析用の流路の作製を行った。サイズに依存した細胞分離チップには、決定論的横置換法と呼ばれる流路上に細かなマイクロピラーを配置した粒子の分離技法を転用した。理論上の細胞分離直径を8.3μmとしたチップを設計および作製した。圧力ポンプによってチップに細胞を送液し、特定の出口から回収された細胞の面積を計測した．本細胞分離チップによって，大・小のビーズが高い精度で分離できることを確認したのち、ホルマリン固定したクルマエビ血球細胞をチップに送液した。その結果、顕微鏡下の面積が90μm2以上のクルマエビ血球細胞が特定の出口に濃縮されていた。本チップについては現在、より高精度な分離に向けてデザインの検討を行っている。シングルセルmRNA解析チップには、既報の3系統送液チップのデザインを適用した。圧力ポンプを用いて細胞およびmRNAキャプチャービーズをチップに送液し、回収された液滴中に含まれる細胞およびビーズの割合を計測した。その結果、液滴中に細胞またはビーズがそれぞれ5%ほど封入されていた。細胞とビーズの共封入確率は0.3%ほどであり、1回の実験で約3,000個の細胞由来のmRNAが解析可能であることが示唆された。その後、メタノール固定したヒトおよびマウス由来の細胞株を用いて、シングルセルの液滴内への封入およびmRNAキャプチャービーズへの結合、逆転写反応を行い、次世代シークエンサー用のライブラリーを作製した。本ライブラリーをMiseqにてシークエンシングした結果、約500細胞が解析され、1細胞あたり3000遺伝子転写産物がシークエンス可能であった。