覚醒・睡眠に必須な神経細胞種の発現解析による睡眠圧の分子実体の探索

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前年度までにジフテリア毒素 (DTA)を発現するAAVを、神経細胞種特異的にCreを発現するマウスに注入する実験から、PB/PC領域のグルタミン酸作動性神経細胞が覚醒の制御に重要な役割を果たす可能性が示唆された。そこでこの神経細胞種特異的な発現解析を行うために、標的神経細胞をEGFP-rpl10aでラベルし、LMDで切り出す実験系を確立した。次にこの系を利用してPB/PCの神経細胞種特異的な発現解析を行った。具体的には上記で確立した方法で、断眠を施したマウスとコントロールマウスのPB/PC領域のグルタミン酸作動性神経細胞のみを個体ごとに１００細胞回収し、RNA-Seq解析により遺伝子発現解析を行った。有意に変化した遺伝子群に対してGO解析を行った結果、断眠によって減少した遺伝子群にはカルシウムイオン輸送に関わる遺伝子群等が存在する一方で、断眠によって上昇した遺伝子群には免疫応答に関わる遺伝子群等が存在することが分かった。またさらに１細胞レベルでの解析を行うために、回収方法等の検討を行った結果、LMDで回収した1神経細胞からでも高品質なRNA-seq libraryを合成できる方法を確立することができた。一方、睡眠に必須な神経細胞種を特定するために、ノンレム睡眠への導入を制御すると報告されているPOA領域の神経細胞の除去実験を行った。具体的にはTEV proteaseに切断を受けるよう改変したprocaspase-3とTEV proteaseの２つが発現するAAVを用いてPOA領域の神経細胞除去を行い睡眠覚醒に及ぼす影響を検証した結果、睡眠覚醒が断片化することがわかった。本研究成果は睡眠および断眠が個体に及ぼす分子的変化の実態の解明につながる可能性がある。