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多様な芳香族化合物を取り込む細菌外膜トランスポーターの同定とその物質生産への応用

吸收各种芳香族化合物的细菌外膜转运蛋白的鉴定及其在物质生产中的应用

基本信息

批准号：
19J11312
负责人：
藤田雅也
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

プロトカテク酸(PCA)、シリンガ酸(SA)、フェルラ酸(FA)によりそれぞれ転写誘導を受けるTonB-dependent transporter (TBDT)様遺伝子の破壊株について、当該基質の変換能と生育能を測定したが、破壊により変換能と生育能が低下するTBDT様遺伝子は見受けられなかった。リグニン由来芳香族化合物の取り込みに関与するTonB-ExbB-ExbD複合体(Ton複合体)の成分を明らかにするために、まずSYK-6株が有する6つのtonB様遺伝子のうち、遺伝子破壊株を取得できないtonB1と、鉄の取り込みに関与するtonB2を除く、tonB3-6の単独破壊株、および多重破壊株のリグニン由来芳香族化合物(11種類)の変換能と生育能を評価したが、これらの破壊株の変換能、生育能は野生株と同等であった。SYK-6株が3つずつ有するexbB、exbD様遺伝子のうち、exbB2/tolQ、exbD3/tolRは外膜構造の安定化に関与することが示された。遺伝子破壊株が取得できないtonB1-exbB1-exbD1-exbD2(tonB1オペロン遺伝子)については、プラスミドによりSYK-6株で高発現させた場合に、PCA、SA、FAを含む7種類のリグニン由来芳香族化合物の変換能が向上したため、取り込みへの関与が強く示唆された。5,5’-dehydrodivanillateを取り込むTBDTであるDdvTの生化学的な解析を行うために、精製タンパク質の取得を試みた。ddvTをプラスミドで大腸菌BL21(DE3)に導入し発現させたところ、DdvTが封入体を形成したため、尿素を用いたrefoldingによる封入体からの精製を試みた。その結果、size-exclusion chromatographyにより単分散のピークが確認されたため、封入体からDdvTを精製することに成功した。

Protaca acid (PCA), salicyclic acid (SA), and fucaric acid (FA) are all sensitive to transcription induction. When the transformation energy and fertility of the substrate are determined, TBDT genes with low transformation energy and fertility are found to be sensitive to transcription induction. The composition of the TonB-ExbB-ExbD complex (Ton complex) is determined by the following: (1) The tonB-ExbB-ExbD complex (Ton complex) is composed of 6 strains of SYK-6 and 6 strains of tonB-ExbD complex. The results showed that the conversion and fertility of aromatic compounds (11 species) were evaluated, and the conversion and fertility of wild plants were evaluated. SYK-6 strain has exbB, exbD, exbB2/tolQ, exbD3/tolR and stability of outer membrane structure. In case of high occurrence of SYK-6 strain, PCA, SA, FA, etc., 7 kinds of aromatic compounds are selected from aromatic compounds, and their conversion energy is increased. 5,5 ′-dehydrodihydrochloride is selected from TBDT, DdvT and DdvT. DdvT was introduced into E. coli BL21 (DE3), and the formation and purification of DdvT enclosures were studied. The results, size-exclusion chromatography, and encapsulation were successful.