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遺伝子編集技術を駆使したＨＢＶ感染維持機構に関わる因子の網羅的同定と介入法の開発

利用基因编辑技术全面识别乙肝病毒感染维持机制相关因素并开发干预方法

基本信息

批准号：
19J11829
负责人：
關場一磨
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J11829/
关键词：
B型肝炎ウイルス cccDNA ウイルス-宿主相互作用遺伝子編集

项目摘要

前年度に引き続き、B型肝炎ウイルス（HBV）複製の鋳型であるcovalently closed circular DNA（cccDNA）に付随して存在する蛋白群の網羅的同定および機能解析を行った。HBV持続感染能を有し、特定のDNA配列近傍に存在する蛋白を網羅的にビオチン化することのできる肝細胞株（NTCP; deadCas9-BioID2強制発現細胞）に対し、HBV感染のうえ、cccDNAを認識するguide RNAを導入した。ここで、dCas9-BioID2はDNA切断能を持たないdeadCas9と距離依存性ビオチン化酵素BioID2との融合蛋白である。次いで、ビオチン化されたcccDNA近傍蛋白を免疫沈降し、質量分析法で網羅的に同定した。同定された宿主蛋白について、個別の特異的抗体で免疫沈降し、cccDNAの共沈の有無をdroplet digital PCRで検証した。これによりcccDNAに結合していることが示された蛋白については、個別に細胞株でノックアウトし、HBV感染系におけるウイルス産物量の変化を検証した。ウイルス量の変化が有意であった宿主蛋白は、cccDNAと結合しHBV感染維持に関わっていると考えられた。以上、本研究によりHBV感染維持に関わる宿主蛋白を複数同定する事ができた。こうしたウイルス-宿主相互作用はHBV排除に向けた新たな治療標的として有望と考えられる。今後は、この作用機序を実験的にさらに検証していく。

In the previous year, hepatitis B virus virus (HBV) and hepatitis B virus (HBV) replication virus covalently closed circular DNA (cccDNA) can be analyzed by the same protocol mechanism that exists in the protein group Internet. HBV infection can be detected, specific DNA collocation exists near the protein network, HBV infection can be detected, HBV infection can be detected, cccDNA infection can be detected, guide RNA infection can be detected. DNA cleavage of deadCas9 and dCas9-BioID2 fragments could maintain the isolation dependence of the enzyme BioID2 and the fusion protein. Sub-assay and quantitative analysis were used to determine the identity of cccDNA near-protein immunoprecipitation assay and quantitative analysis network. There was no droplet digital PCR antigen in the host protein, specific antibody immunoprecipitation and cccDNA co-precipitation in the same group. The results of cccDNA and Elisa showed that the expression of protein, cell line and HBV infection line were detected by Elisa. It is intended to detect the host protein and combine cccDNA with HBV infection to maintain the quality of the host protein. In this study, the multiplicity of host protein in the maintenance of HBV infection was the same. It is expected that the host interaction HBV will rule out the new treatment. In the future, the mechanism of action in the future will lead to an increase in the number of patients.