遺伝子編集技術を駆使したＨＢＶ感染維持機構に関わる因子の網羅的同定と介入法の開発

前年度に引き続き、B型肝炎ウイルス（HBV）複製の鋳型であるcovalently closed circular DNA（cccDNA）に付随して存在する蛋白群の網羅的同定および機能解析を行った。HBV持続感染能を有し、特定のDNA配列近傍に存在する蛋白を網羅的にビオチン化することのできる肝細胞株（NTCP; deadCas9-BioID2強制発現細胞）に対し、HBV感染のうえ、cccDNAを認識するguide RNAを導入した。ここで、dCas9-BioID2はDNA切断能を持たないdeadCas9と距離依存性ビオチン化酵素BioID2との融合蛋白である。次いで、ビオチン化されたcccDNA近傍蛋白を免疫沈降し、質量分析法で網羅的に同定した。同定された宿主蛋白について、個別の特異的抗体で免疫沈降し、cccDNAの共沈の有無をdroplet digital PCRで検証した。これによりcccDNAに結合していることが示された蛋白については、個別に細胞株でノックアウトし、HBV感染系におけるウイルス産物量の変化を検証した。ウイルス量の変化が有意であった宿主蛋白は、cccDNAと結合しHBV感染維持に関わっていると考えられた。以上、本研究によりHBV感染維持に関わる宿主蛋白を複数同定する事ができた。こうしたウイルス-宿主相互作用はHBV排除に向けた新たな治療標的として有望と考えられる。今後は、この作用機序を実験的にさらに検証していく。

前年度に引き続き、B型肝炎ウイルス（HBV）複製の鋳型であるcovalently closed circular DNA（cccDNA）に付随して存在する蛋白群の網羅的同定および機能解析を行った。HBV持続感染能を有し、特定のDNA配列近傍に存在する蛋白を網羅的にビオチン化することのできる肝細胞株（NTCP; deadCas9-BioID2強制発現細胞）に対し、HBV感染のうえ、cccDNAを認識するguide RNAを導入した。ここで、dCas9-BioID2はDNA切断能を持たないdeadCas9と距離依存性ビオチン化酵素BioID2との融合蛋白である。次いで、ビオチン化されたcccDNA近傍蛋白を免疫沈降し、質量分析法で網羅的に同定した。同定された宿主蛋白について、個別の特異的抗体で免疫沈降し、cccDNAの共沈の有無をdroplet digital PCRで検証した。これによりcccDNAに結合していることが示された蛋白については、個別に細胞株でノックアウトし、HBV感染系におけるウイルス産物量の変化を検証した。ウイルス量の変化が有意であった宿主蛋白は、cccDNAと結合しHBV感染維持に関わっていると考えられた。以上、本研究によりHBV感染維持に関わる宿主蛋白を複数同定する事ができた。こうしたウイルス-宿主相互作用はHBV排除に向けた新たな治療標的として有望と考えられる。今後は、この作用機序を実験的にさらに検証していく。