加齢性疾患診断マーカー探索を目的としたタンパク質中アミノ酸残基のキラル分析法開発

开发蛋白质氨基酸残基的手性分析方法以寻找与年龄相关的疾病诊断标记物

• 批准号: 19J12809
• 负责人: 石井 千晴
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12809/
• 关键词: 分析化学; D-アミノ酸残基; 多次元HPLC; 質量分析

本研究では、様々な加齢性疾患の早期診断マーカーや治療標的として近年注目されている“タンパク質中D-アミノ酸残基”の網羅的精密分析法の開発を行った。タンパク質における微量D-アミノ酸残基を正確に分析するためには、複数の分離モードを組み合わせた二次元HPLC、重塩酸加水分解および質量分析（MS/MS）を統合する方法が有用であると期待されており、前年度までに代表的な10種のアミノ酸残基を対象とした一斉分析法を構築した。本年度は実際のヒト疾患試料を分析するとともに、これまで分析困難であったアミノ酸の前処理法について検討した。ヒト疾患試料としては、九州大学病院との共同研究により収集した水晶体タンパク質（白内障患者）を使用した。水晶体クリスタリン中では加齢に伴うアスパラギン酸（Asp）残基の異性化が報告されているが、今回解析を行った結果、多量のD-Asp残基に加えて比較的多量のD体が検出されるアミノ酸残基が新たに認められた。これらのアミノ酸残基は白内障における新規治療標的になり得ると考えられ、本分析法の医療応用が期待される。酸加水分解による分析が困難なシステイン（Cys）残基については、還元カルボキシメチル（CM）化反応を用いる前処理を検討した。CM化によりチオール基が保護されたCys残基は重塩酸加水分解および二次元キラルHPLC-MS/MSシステムによる定量分析が可能であり、今後は様々な加齢・劣化タンパク質試料の分析が期待される。また、同じく分析が困難であったAsp/アスパラギン（Asn）/グルタミン酸/グルタミン残基の一斉キラル識別分析については、ホフマン転位反応を用いた前処理により、様々なタンパク質・ペプチド試料の分析を行った。その結果、劣化モデルタンパク質（pH 7.0、37度で16週間保存したマウスリゾチーム）において保存期間の延長に伴うD-Asn残基の異性化が認められた。

The purpose of this study is to develop a precision analytical method for the early diagnosis and treatment of acute diseases, which has attracted much attention in recent years. A method for the accurate analysis of trace amounts of D-amino acid residues was developed by combining binary HPLC and mass spectrometry (MS/MS). This year, the analysis of the sample was difficult and the acid pretreatment method was discussed. A joint study conducted by Kyushu University Hospital on the use of cataract specimens In the crystal structure, there are many different kinds of D-Asp residues, which are reported in this paper. This analysis is expected to be used in the medical treatment of cataract. The analysis of acid hydrolysis is difficult, and the analysis of Cys residues is difficult. The quantitative analysis of CM, Cys, HPLC-MS/MS and Cys residues is possible and expected in the future. Analysis of Asp/Asp (Asn)/Asp (Asp (Asn)/Asp (As As a result, it is recognized that the deterioration of the quality of (pH 7.0, 37 degrees Celsius, 16 weeks of storage) is accompanied by the prolongation of the storage period and the isomerization of D-Asn residues.

项目成果

D-Amino acid oxidase deficiency is caused by a large deletion in the Dao gene in LEA rats

• DOI: 10.1016/j.bbapap.2020.140463
• 发表时间: 2020-09-01
• 期刊: BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS
• 影响因子: 3.2
• 作者: Shimizu，Yukiko;Ishii，Chiharu;Okamura，Tadashi
• 通讯作者: Okamura，Tadashi

Development of a highly selective two-dimensional HPLC-MS/MS system for the screening of intrinsic D-amino acids in human clinical samples

开发高选择性二维 HPLC-MS/MS 系统，用于筛选人类临床样品中的内在 D-氨基酸

• 发表时间: 2019
• 作者: Chiharu ISHII;Takeyuki AKITA;Masashi MITA;Tomomi IDE;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE

Metabolism of microbial D-amino acids in mammals

哺乳动物中微生物 D-氨基酸的代谢

• 发表时间: 2019
• 作者: Jumpei SASABE;Masataka SUZUKI;Yusuke GONDA;Chiharu ISHII;Maiko NAKANE;Masashi MITA;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE

Analysis of D-amino acids in biological matrices

生物基质中 D-氨基酸的分析

• DOI: 10.14952/seikagaku.2019.910301
• 发表时间: 2019
• 期刊: 生化学
• 作者: 石井 千晴;古賀 鈴依子;浜瀬 健司
• 通讯作者: 浜瀬 健司

Determination of phenylalanine enantiomers in mammalian plasma and urine using two-dimensional HPLC

使用二维 HPLC 测定哺乳动物血浆和尿液中的苯丙氨酸对映体

• 发表时间: 2019
• 作者: Sui-Wen HSIAO;Chiharu ISHII;Aogu FURUSHO;Takeyuki AKITA;Masashi MITA;Tomomi IDE;Ching-Kuo LEE;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE