加齢性疾患診断マーカー探索を目的としたタンパク質中アミノ酸残基のキラル分析法開発

开发蛋白质氨基酸残基的手性分析方法以寻找与年龄相关的疾病诊断标记物

• 批准号: 19J12809
• 负责人: 石井 千晴
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12809/
• 关键词: 分析化学; D-アミノ酸残基; 多次元HPLC; 質量分析

本研究では、様々な加齢性疾患の早期診断マーカーや治療標的として近年注目されている“タンパク質中D-アミノ酸残基”の網羅的精密分析法の開発を行った。タンパク質における微量D-アミノ酸残基を正確に分析するためには、複数の分離モードを組み合わせた二次元HPLC、重塩酸加水分解および質量分析（MS/MS）を統合する方法が有用であると期待されており、前年度までに代表的な10種のアミノ酸残基を対象とした一斉分析法を構築した。本年度は実際のヒト疾患試料を分析するとともに、これまで分析困難であったアミノ酸の前処理法について検討した。ヒト疾患試料としては、九州大学病院との共同研究により収集した水晶体タンパク質（白内障患者）を使用した。水晶体クリスタリン中では加齢に伴うアスパラギン酸（Asp）残基の異性化が報告されているが、今回解析を行った結果、多量のD-Asp残基に加えて比較的多量のD体が検出されるアミノ酸残基が新たに認められた。これらのアミノ酸残基は白内障における新規治療標的になり得ると考えられ、本分析法の医療応用が期待される。酸加水分解による分析が困難なシステイン（Cys）残基については、還元カルボキシメチル（CM）化反応を用いる前処理を検討した。CM化によりチオール基が保護されたCys残基は重塩酸加水分解および二次元キラルHPLC-MS/MSシステムによる定量分析が可能であり、今後は様々な加齢・劣化タンパク質試料の分析が期待される。また、同じく分析が困難であったAsp/アスパラギン（Asn）/グルタミン酸/グルタミン残基の一斉キラル識別分析については、ホフマン転位反応を用いた前処理により、様々なタンパク質・ペプチド試料の分析を行った。その結果、劣化モデルタンパク質（pH 7.0、37度で16週間保存したマウスリゾチーム）において保存期間の延長に伴うD-Asn残基の異性化が認められた。

在这项研究中，我们为“蛋白质中的D-氨基酸残基”开发了一种全面，精确的分析方法，这些方法最近引起了人们对各种年龄相关疾病的早期诊断标记和治疗靶标的关注。为了准确分析蛋白质中的痕量D-氨基酸残基，预计将二维HPLC，生物氯化物水解和质谱（MS/MS）整合的方法结合在一起，该方法结合了多个分离模式是有用的，直到上一年，直到上一年，一种同时的分析方法靶向十个代表性的氨基酸残基是构建的。今年，我们分析了实际的人类疾病样本并检查了氨基酸的预处理方法，到目前为止，这些方法一直很难分析。作为人类疾病样本，使用了与京胡大学医院合作收集的晶状体蛋白（白内障患者）。据报道，已经报道了与结晶蛋白年龄的天冬氨酸（ASP）残基的异构化，但是由于这种分析，发现了新的氨基酸残基，其中除了大量的D-ASP残基外还发现了大量的D-ASP残基。这些氨基酸残基被认为是白内障中的新型治疗靶标，预计该分析方法的医疗应用。对于难以通过酸水解来分析的半胱氨酸（CYS）残基，研究了使用羧甲基（CM）反应减少的预处理。用二维二维的水解和定量分析，使用二维手性HPLC-MS/MS系统进行生物氯化酸水解和定量分析，预计将来将分析各种衰老和降解的蛋白质样品。此外，对于同时对ASP/天冬酰胺（ASN）/谷氨酸/谷氨酰胺残基的手性歧视分析（也难以分析），使用Hoffmann重排反应通过预处理分析了各种蛋白质和肽样品。结果，在降解模型蛋白（小鼠溶菌酶在pH 7.0，37°C下储存16周）中观察到D-ASN残基异构化。

项目成果

D-Amino acid oxidase deficiency is caused by a large deletion in the Dao gene in LEA rats

• DOI: 10.1016/j.bbapap.2020.140463
• 发表时间: 2020-09-01
• 期刊: BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS
• 影响因子: 3.2
• 作者: Shimizu，Yukiko;Ishii，Chiharu;Okamura，Tadashi
• 通讯作者: Okamura，Tadashi

Metabolism of microbial D-amino acids in mammals

哺乳动物中微生物 D-氨基酸的代谢

• 发表时间: 2019
• 作者: Jumpei SASABE;Masataka SUZUKI;Yusuke GONDA;Chiharu ISHII;Maiko NAKANE;Masashi MITA;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE

Development of a highly selective two-dimensional HPLC-MS/MS system for the screening of intrinsic D-amino acids in human clinical samples

开发高选择性二维 HPLC-MS/MS 系统，用于筛选人类临床样品中的内在 D-氨基酸

• 发表时间: 2019
• 作者: Chiharu ISHII;Takeyuki AKITA;Masashi MITA;Tomomi IDE;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE

Analysis of D-amino acids in biological matrices

生物基质中 D-氨基酸的分析

• DOI: 10.14952/seikagaku.2019.910301
• 发表时间: 2019
• 期刊: 生化学
• 作者: 石井 千晴;古賀 鈴依子;浜瀬 健司
• 通讯作者: 浜瀬 健司

Determination of phenylalanine enantiomers in mammalian plasma and urine using two-dimensional HPLC

使用二维 HPLC 测定哺乳动物血浆和尿液中的苯丙氨酸对映体

• 发表时间: 2019
• 作者: Sui-Wen HSIAO;Chiharu ISHII;Aogu FURUSHO;Takeyuki AKITA;Masashi MITA;Tomomi IDE;Ching-Kuo LEE;Kenji HAMASE
• 通讯作者: Kenji HAMASE