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機能性膜タンパク質搭載細胞外ベシクルの設計とＤＤＳ応用

负载功能膜蛋白的细胞外囊泡设计及DDS应用

基本信息

批准号：
19J15093
负责人：
石川良賀
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までの研究成果において、免疫チェックポイントタンパク質PD-1の遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、昆虫細胞が放出した細胞外ベシクル（EV）の物性評価および機能評価を行ってきた。2020年度は、PD-1提示EV（PD-1 EV）上のウイルス由来膜融合性タンパク質gp64の機能を利用し、PD-1 EVと人工脂質膜小胞リポソームを融合した新規ハイブリッドEVの構築と融合挙動の詳細な解析を行い、さらにハイブリッドEV内包物の細胞質内デリバリー機能を評価した。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いたアッセイにより、gp64のpH応答的な膜融合機能を評価した。EVとFRETリポソームを酸性条件で混合すると、EV濃度依存的なFRETの解消が確認されたことから、EVとリポソームが酸性環境に応答して融合しているが分かった。イメージングフローサイトメトリーを用いて、EVとリポソームの膜融合効率を単一粒子レベルで解析したところ、膜融合が100%進行する条件を見出し、さらにEVとリポソームの混合比によりハイブリッドEVの表面組成を制御し得ることが明らかとなった。また、蛍光標識デキストランを内包したリポソームを調製し、EVと酸性条件で融合することでデキストラン内包ハイブリッドEVを作製した。これをHeLa細胞に添加し共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、ハイブリッドEVが細胞内に取り込まれた後、後期エンドソームやリソソームなどの酸性オルガネラに輸送され、さらに内包物のデキストランが細胞質へと放出された。またプロトンポンプ阻害剤でHeLa細胞を前処理すると、デキストランとオルガネラの共局在率が上昇することが確認された。つまりハイブリッドEVは、gp64を介した酸性オルガネラとの膜融合により内包物を細胞質へと送達可能なDDSキャリアとして機能することが明らかとなった。

Yesterday's annual までの research において, immune チェックポイントタンパク qualitative traces of PD 1 の伝 son を group み込んだバキュロウイルスを insect cell に infection さがせ, insect cells release した extracellular ベシクル (EV) の property review 価および function evaluation 価を line ってきた. In 2020, and PD-1 suggested that in EV (PD-1 EV), <s:1> ウ and スス are the sources of membrane fusion タ and パ. The function of the gp64 photons in the aura を utilizes and PD-1 Bilayer lipid membrane EV と vesicular リポソームを fusion した new rules ハイブリッド EV の build と fusion 挙 dynamic の detailed analytical をない, さらにハイブリッド EV package content within the cytoplasm デのリバリー function を review 価した. 蛍 resonance light エネルギー mobile (FRET) をいたアッセイにより, gp64 の pH 応 a な membrane fusion function を review 価した. EV と FRET リポソームを acid condition mixed ですると, EV concentration dependent な FRET の null が confirm されたことから, EV とリポソームが acid environment に応 answer して fusion しているが points かった. イメージングフローサイトメトリーを with いて, EV とリポソームの membrane fusion rate of unseen を単 a particle レベルで parsing したところ, membrane fusion が 100% する conditions を see し, さらに EV とリポソームの mixing ratio によりハイブリッド EV の surface composition を suppression し have ることが Ming らかとなった. また蛍 light logo デキストランを insourcing したリポソームを modulation fusion ですし, EV と acidic conditions ることでデキストラン insourcing ハイブリッド EV を cropping した. これを HeLa に add し total focus レーザー顕 micromirror で観 examine したところ, ハイブリッド EV が intracellular に take り込まれた, late after エンドソームやリソソームなどの acid オルガネラに conveying され, さらに insourcing content のデキストランが cytoplasm へと release された. またプロトンポンプ resistance against tonic で HeLa を処 before Richard すると, デキストランとオルガネラの rising rate of total bureau in がすることが confirm された. つまりハイブリッド EV は, gp64 を interface した acid オルガネラとの membrane fusion により insourcing content を cytoplasm へと served may な DDS キャリアとして function することが Ming らかとなった.