機能性膜タンパク質搭載細胞外ベシクルの設計とDDS応用

负载功能膜蛋白的细胞外囊泡设计及DDS应用

基本信息

  • 批准号:
    19J15093
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.09万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2019
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2019-04-25 至 2021-03-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

昨年度までの研究成果において、免疫チェックポイントタンパク質PD-1の遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、昆虫細胞が放出した細胞外ベシクル(EV)の物性評価および機能評価を行ってきた。2020年度は、PD-1提示EV(PD-1 EV)上のウイルス由来膜融合性タンパク質gp64の機能を利用し、PD-1 EVと人工脂質膜小胞リポソームを融合した新規ハイブリッドEVの構築と融合挙動の詳細な解析を行い、さらにハイブリッドEV内包物の細胞質内デリバリー機能を評価した。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたアッセイにより、gp64のpH応答的な膜融合機能を評価した。EVとFRETリポソームを酸性条件で混合すると、EV濃度依存的なFRETの解消が確認されたことから、EVとリポソームが酸性環境に応答して融合しているが分かった。イメージングフローサイトメトリーを用いて、EVとリポソームの膜融合効率を単一粒子レベルで解析したところ、膜融合が100%進行する条件を見出し、さらにEVとリポソームの混合比によりハイブリッドEVの表面組成を制御し得ることが明らかとなった。また、蛍光標識デキストランを内包したリポソームを調製し、EVと酸性条件で融合することでデキストラン内包ハイブリッドEVを作製した。これをHeLa細胞に添加し共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、ハイブリッドEVが細胞内に取り込まれた後、後期エンドソームやリソソームなどの酸性オルガネラに輸送され、さらに内包物のデキストランが細胞質へと放出された。またプロトンポンプ阻害剤でHeLa細胞を前処理すると、デキストランとオルガネラの共局在率が上昇することが確認された。つまりハイブリッドEVは、gp64を介した酸性オルガネラとの膜融合により内包物を細胞質へと送達可能なDDSキャリアとして機能することが明らかとなった。
Yesterday's annual ま で の research に お い て, immune チ ェ ッ ク ポ イ ン ト タ ン パ ク qualitative traces of PD 1 の 伝 son を group み 込 ん だ バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を insect cell に infection さ が せ, insect cells release し た extracellular ベ シ ク ル (EV) の property review 価 お よ び function evaluation 価 を line っ て き た. In 2020, and PD-1 suggested that in EV (PD-1 EV), <s:1> ウ and ス ス are the sources of membrane fusion タ and パ. The function of the gp64 photons in the aura を utilizes and PD-1 Bilayer lipid membrane EV と vesicular リ ポ ソ ー ム を fusion し た new rules ハ イ ブ リ ッ ド EV の build と fusion 挙 dynamic の detailed analytical を な い, さ ら に ハ イ ブ リ ッ ド EV package content within the cytoplasm デ の リ バ リ ー function を review 価 し た. 蛍 resonance light エ ネ ル ギ ー mobile (FRET) を い た ア ッ セ イ に よ り, gp64 の pH 応 a な membrane fusion function を review 価 し た. EV と FRET リ ポ ソ ー ム を acid condition mixed で す る と, EV concentration dependent な FRET の null が confirm さ れ た こ と か ら, EV と リ ポ ソ ー ム が acid environment に 応 answer し て fusion し て い る が points か っ た. イ メ ー ジ ン グ フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を with い て, EV と リ ポ ソ ー ム の membrane fusion rate of unseen を 単 a particle レ ベ ル で parsing し た と こ ろ, membrane fusion が 100% す る conditions を see し, さ ら に EV と リ ポ ソ ー ム の mixing ratio に よ り ハ イ ブ リ ッ ド EV の surface composition を suppression し have る こ と が Ming ら か と な っ た. ま た 蛍 light logo デ キ ス ト ラ ン を insourcing し た リ ポ ソ ー ム を modulation fusion で す し, EV と acidic conditions る こ と で デ キ ス ト ラ ン insourcing ハ イ ブ リ ッ ド EV を cropping し た. こ れ を HeLa に add し total focus レ ー ザ ー 顕 micromirror で 観 examine し た と こ ろ, ハ イ ブ リ ッ ド EV が intracellular に take り 込 ま れ た, late after エ ン ド ソ ー ム や リ ソ ソ ー ム な ど の acid オ ル ガ ネ ラ に conveying さ れ, さ ら に insourcing content の デ キ ス ト ラ ン が cytoplasm へ と release さ れ た. ま た プ ロ ト ン ポ ン プ resistance against tonic で HeLa を 処 before Richard す る と, デ キ ス ト ラ ン と オ ル ガ ネ ラ の rising rate of total bureau in が す る こ と が confirm さ れ た. つ ま り ハ イ ブ リ ッ ド EV は, gp64 を interface し た acid オ ル ガ ネ ラ と の membrane fusion に よ り insourcing content を cytoplasm へ と served may な DDS キ ャ リ ア と し て function す る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

期刊论文数量(6)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Development of engineered extracellular vesicles expressing immune checkpoint protein PD-1 by fusion with liposomes
通过与脂质体融合表达免疫检查点蛋白 PD-1 的工程化细胞外囊泡的开发
  • DOI:
  • 发表时间:
    2019
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    R. Ishikawa;S. Yoshida;S. Sawada;S. Mukai;Y. Sasaki;K. Akiyoshi
  • 通讯作者:
    K. Akiyoshi
バイオ医薬品デリバリーのためのハイブリッド細胞外ベシクルの設計と機能
用于生物药物递送的混合细胞外囊泡的设计和功能
  • DOI:
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    石川良賀;吉田昭介;澤田晋一;佐々木善浩;秋吉一成
  • 通讯作者:
    秋吉一成
Development of Lectin-immobilized Spongy Monoliths for Sub-classification of Exosome
用于外泌体亚分类的凝集素固定海绵块的开发
  • DOI:
    10.2116/bunsekikagaku.69.731
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0.2
  • 作者:
    久保拓也*;加藤誠也;下田麻子;石川良賀;澤田晋一;佐々木善浩;秋吉一成;大塚浩二
  • 通讯作者:
    大塚浩二
Preparation of engineered extracellular vesicles with full-length functional PD-1 membrane proteins by baculovirus expression system
膜タンパク質エンジニアリング昆虫由来細胞外ベシクルの開発とバイオ応用
膜蛋白工程昆虫细胞外囊泡的开发及生物应用
  • DOI:
  • 发表时间:
    2019
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    石川良賀,吉田昭介,澤田晋一,向井貞篤,佐々木善浩,秋吉一成
  • 通讯作者:
    石川良賀,吉田昭介,澤田晋一,向井貞篤,佐々木善浩,秋吉一成
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