試験管内再構成された環状DNA複製サイクルにおける転写翻訳反応の共役

体外重建环状 DNA 复制周期中转录-翻译反应的偶联

• 批准号: 19J20097
• 负责人: 奈良 聖亜
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Rikkyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J20097/
• 关键词: ゲノム複製; 自己複製

本研究では、試験管内で再構成した大腸菌ゲノム複製反応(RCR)と転写・翻訳反応(PURE system)を共役させることによって自己複製システムの構築を目指す。RCRは、25種のタンパク質を用いて大腸菌ゲノム複製システムを再構成した系であり、複製開始起点oriCを含む環状DNAを指数関数的に増幅する反応である。RCRとPURE systemの共役は、RCRに必要な複製タンパク質を遺伝子として有するoriC環状DNA(自己複製ゲノム)を鋳型に、PURE systemを用いて複製タンパク質を産生し、さらに、産生した複製タンパク質を用いて鋳型となった自己複製ゲノムの増幅を導くことで達成される。これまでに、RCRに含まれる複製タンパク質の1つ(複製開始タンパク質DnaA)について、この共役に成功していた。しかし、鋳型ゲノムDNA分子が多数含まれるバルクの反応系では、産生されたDnaA分子が自身の鋳型ゲノムDNA分子以外を複製する可能性があるため、真に自己複製が達成されているとは言い難かった。そこで、油中水滴エマルジョンを用いて反応系を区画化し、1分子の鋳型ゲノムDNA毎に共役反応を行うことを検討した。この時、1分子の鋳型ゲノムDNA上で複製と転写が同時に起こるため、複製装置と転写装置の衝突を解消することが課題であった。既にバルクの共役系において、大腸菌で働く複製と転写の衝突回避機構が鋳型ゲノムDNAの増幅を促進することが明らかになっており、この機構をエマルジョンを用いた共役系にも導入したところ鋳型ゲノムDNAの増幅促進が見られた。この結果は、生命システムの根幹となるゲノムの自己複製を達成するためには複製と転写の協調的な進行が重要になることを示しており、細胞が実際に行う1分子のゲノムDNAを基にした複製・転写・翻訳、すなわちセントラルドグマを試験管内で再現することに繋がる。

The present study is aimed at the construction of recombinant E. coli replication system (RCR) and PURE system in vitro. RCR has 25 kinds of DNA. It has 25 kinds of DNA. RCR and PURE system are used to generate, reproduce and amplify the DNA sequence necessary for RCR to replicate the DNA sequence. RCR includes copy start, copy start. Most of the DNA molecules in the genome contain the same DnaA sequence as the DnaA molecules in the genome, and the DnaA molecules in the genome have the same DnaA sequence as the DnaA molecules themselves. The DNA of a single molecule was isolated from the DNA of a single molecule. The problem of simultaneous initiation, duplication and duplication of DNA in the DNA molecule is the resolution of conflicts between replication and duplication devices. Both in the common service system and in the E. coli, replication and conflict avoidance mechanisms are used to promote DNA amplification. The result is that the root of a cell must replicate itself, and the coordination of DNA replication must occur in the cell.

项目成果

Overcoming the Challenges of Megabase-Sized Plasmid Construction in Escherichia coli

• DOI: 10.1021/acssynbio.0c00008
• 发表时间: 2020-06-19
• 期刊: ACS SYNTHETIC BIOLOGY
• 影响因子: 4.7
• 作者: Mukai, Takahito;Yoneji, Tatsuya;Su'etsugu, Masayuki
• 通讯作者: Su'etsugu, Masayuki

Novel plasmids were isolated from natural environmental samples using Replication-Cycle Reaction (RCR)

使用复制循环反应 (RCR) 从自然环境样品中分离出新型质粒

• 发表时间: 2020
• 作者: Mitsuya Mori;Seia Nara;Masayuki Su’etsugu;Kazuhide Kimbara; Masaki Shintani
• 通讯作者: Masaki Shintani

大腸菌染色体複製サイクル再構成系を基盤とした自己複製システムの構築

基于大肠杆菌染色体复制周期重构系统的自我复制系统的构建

• 发表时间: 2020
• 作者: 奈良聖亜;長谷部友憲;高田啓;末次正幸
• 通讯作者: 末次正幸

複数の複製起点を持つ長鎖環状DNAの試験管内増幅反応における増殖効率について

具有多个复制起点的长环状 DNA 的体外扩增反应中的生长效率

• 发表时间: 2019
• 作者: 藤田裕寛;奈良聖亜;向井崇人;末次正幸
• 通讯作者: 末次正幸

Replication-Cycle Reaction法による環境試料からの環状DNAの収集・解析

使用复制循环反应方法从环境样品中收集和分析环状 DNA

• 发表时间: 2021
• 作者: Maho Tokuda;Haruo Suzuki;Masahiro Yuki;Moriya Ohkuma;Kazuhide Kimbara;Masaki Shintani;德田真穂，鈴木治夫，雪真弘，大熊盛也，金原和秀，新谷政己;山本雪絵，陶山哲志，髙木妙子，大田悠里，野田尚宏，金原和秀，新谷政己;白木友博，山本雪絵，千葉怜碧，德田真穂，金原和秀，新谷政己;上條達哉，金原和秀，新谷政己;金子健成，金原和秀，新谷政己;梅木穂乃花，德田真穂，雪真弘，大熊盛也，金原和秀，新谷政己;一瀬拓海，池田奈菜子，森光矢，奈良聖亜，末次正幸，金原和秀，新谷政己
• 通讯作者: 一瀬拓海，池田奈菜子，森光矢，奈良聖亜，末次正幸，金原和秀，新谷政己