試験管内再構成された環状DNA複製サイクルにおける転写翻訳反応の共役

本研究では、試験管内で再構成した大腸菌ゲノム複製反応(RCR)と転写・翻訳反応(PURE system)を共役させることによって自己複製システムの構築を目指す。RCRは、25種のタンパク質を用いて大腸菌ゲノム複製システムを再構成した系であり、複製開始起点oriCを含む環状DNAを指数関数的に増幅する反応である。RCRとPURE systemの共役は、RCRに必要な複製タンパク質を遺伝子として有するoriC環状DNA(自己複製ゲノム)を鋳型に、PURE systemを用いて複製タンパク質を産生し、さらに、産生した複製タンパク質を用いて鋳型となった自己複製ゲノムの増幅を導くことで達成される。これまでに、RCRに含まれる複製タンパク質の1つ(複製開始タンパク質DnaA)について、この共役に成功していた。しかし、鋳型ゲノムDNA分子が多数含まれるバルクの反応系では、産生されたDnaA分子が自身の鋳型ゲノムDNA分子以外を複製する可能性があるため、真に自己複製が達成されているとは言い難かった。そこで、油中水滴エマルジョンを用いて反応系を区画化し、1分子の鋳型ゲノムDNA毎に共役反応を行うことを検討した。この時、1分子の鋳型ゲノムDNA上で複製と転写が同時に起こるため、複製装置と転写装置の衝突を解消することが課題であった。既にバルクの共役系において、大腸菌で働く複製と転写の衝突回避機構が鋳型ゲノムDNAの増幅を促進することが明らかになっており、この機構をエマルジョンを用いた共役系にも導入したところ鋳型ゲノムDNAの増幅促進が見られた。この結果は、生命システムの根幹となるゲノムの自己複製を達成するためには複製と転写の協調的な進行が重要になることを示しており、細胞が実際に行う1分子のゲノムDNAを基にした複製・転写・翻訳、すなわちセントラルドグマを試験管内で再現することに繋がる。

本研究では、試験管内で再構成した大腸菌ゲノム複製反応(RCR)と転写・翻訳反応(PURE system)を共役させることによって自己複製システムの構築を目指す。RCRは、25種のタンパク質を用いて大腸菌ゲノム複製システムを再構成した系であり、複製開始起点oriCを含む環状DNAを指数関数的に増幅する反応である。RCRとPURE systemの共役は、RCRに必要な複製タンパク質を遺伝子として有するoriC環状DNA(自己複製ゲノム)を鋳型に、PURE systemを用いて複製タンパク質を産生し、さらに、産生した複製タンパク質を用いて鋳型となった自己複製ゲノムの増幅を導くことで達成される。これまでに、RCRに含まれる複製タンパク質の1つ(複製開始タンパク質DnaA)について、この共役に成功していた。しかし、鋳型ゲノムDNA分子が多数含まれるバルクの反応系では、産生されたDnaA分子が自身の鋳型ゲノムDNA分子以外を複製する可能性があるため、真に自己複製が達成されているとは言い難かった。そこで、油中水滴エマルジョンを用いて反応系を区画化し、1分子の鋳型ゲノムDNA毎に共役反応を行うことを検討した。この時、1分子の鋳型ゲノムDNA上で複製と転写が同時に起こるため、複製装置と転写装置の衝突を解消することが課題であった。既にバルクの共役系において、大腸菌で働く複製と転写の衝突回避機構が鋳型ゲノムDNAの増幅を促進することが明らかになっており、この機構をエマルジョンを用いた共役系にも導入したところ鋳型ゲノムDNAの増幅促進が見られた。この結果は、生命システムの根幹となるゲノムの自己複製を達成するためには複製と転写の協調的な進行が重要になることを示しており、細胞が実際に行う1分子のゲノムDNAを基にした複製・転写・翻訳、すなわちセントラルドグマを試験管内で再現することに繋がる。