構造生物学的手法を用いた、自然免疫受容体TLRのシグナル伝達機構の解明

利用结构生物学方法阐明先天免疫受体TLR的信号转导机制

• 批准号: 19J21830
• 负责人: 坂庭 賢太朗
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J21830/
• 关键词: TLR; 自然免疫; 構造生物学; クライオ電子顕微鏡

本研究は，自然免疫において起点となる役割を担うToll様受容体（TLR）のシグナル伝達機構について，構造解析を通じて分子レベルで明らかにすることを目的としている。発現スクリーニングや発現系構築を行い，発現量の良好であったTLR3についての取り組みを進めている。現在までにTLR3全長の可溶化試料を調製し，リガンドである二本鎖RNA（dsRNA）との結合活性を確認した。この試料を人工的な脂質二重膜粒子であるナノディスク（ND）に再構成する条件を検討し，脂質二重膜上で活性化状態を形成したTLR3/dsRNA複合体試料の調製を達成した。クライオ電子顕微鏡を用いて活性化状態での構造解析を行ったところ，～3.3オングストローム分解能で二量体の細胞外ドメイン構造が確認された。全長試料において細胞外ドメインの活性化構造を確認できた一方で，膜貫通領域および細胞内ドメインでは構造決定に至る明瞭な密度を観測することができていない。この点に関して，TLR3の細胞内アダプタータンパク質であるTRIFを調製し，TLR3/dsRNAと複合体を形成することを確認した。しかしながら，このTLR3/dsRNA/TRIF複合体においても膜貫通領域および細胞内領域の密度は不明瞭であり，構造決定には至らなかった。上記の検討の中で，TLR3が二量体よりも大きな会合状態を形成する可能性が示唆されたため，長鎖dsRNAを用いてTLR3の多量体形成について検証を行った。その結果，TLR3/90 bp dsRNAを用いてTLR3四量体のクライオ電顕構造を決定することができた。TLR3の多量体化によりTRIFの効率的な会合を促進しているものと考えられる。以上の結果から，TLR3の多量体化という新たな分子機構を提示することができた。

This study aims to analyze the structure of Toll Receptor (TLR) and its mechanism through molecular analysis. In the process of construction of development system, the quantity of development is good. The soluble sample of TLR3 was prepared and the binding activity of TLR3 double-stranded RNA (dsRNA) was confirmed The preparation of the TL3/dsRNA complex sample was achieved by discussing the conditions for the reconstitution of the artificial lipid double membrane particles and the activation state of the lipid double membrane. The structure analysis of the activated state was carried out by electron microscope, and the extracellular structure of the two molecules was confirmed by ~3.3 ° C. Full-length samples were tested for extracellular activation, membrane penetration, intracellular activation, and structural determination. This is the first time that TRIF has been modulated in TLR3 cells, and TLR3/dsRNA complexes have been identified. TLR3/dsRNA/TRIF complex is composed of membrane penetration domain and intracellular domain. In the above discussion, the possibility of TLR3 forming a two-dimensional, multiple-dimensional, multiple-dimensional state is demonstrated, and long-locked dsRNA is used to detect TLR3. As a result, TLR3/90 bp dsRNA was used to determine the structure of TLR3 tetramer. TLR3's multi-dimensional approach to TRIF's efficiency convergence promotes the development of new technologies. The above results show that TLR3 has a new molecular structure.

项目成果

ntagonist-inactivation mechanism of innate immune receptor TLR8 revealed by X-ray crystal structure analysis

X射线晶体结构分析揭示先天免疫受体TLR8的拮抗剂失活机制

• 发表时间: 2019
• 作者: Padilla-Salinas;R.;Anderson;R.;Sakaniwa;K.;Zhang;S.;Nordeen;P.;Lu;C.;Shimizu;T.;Yin;H.;Kentaro Sakaniwa; Hiromi Tanji; Shuting Zhang; Zhenyi Hu; Hang Yin; Umeharu Ohto; Toshiyuki Shimizu
• 通讯作者: Kentaro Sakaniwa; Hiromi Tanji; Shuting Zhang; Zhenyi Hu; Hang Yin; Umeharu Ohto; Toshiyuki Shimizu

Targeting the innate immune receptor TLR8 using small-molecule agents

• DOI: 10.1107/s2059798320006518
• 发表时间: 2020-07-01
• 期刊: ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION D-STRUCTURAL BIOLOGY
• 影响因子: 2.2
• 作者: Sakaniwa, Kentaro;Shimizu, Toshiyuki
• 通讯作者: Shimizu, Toshiyuki

Rationally Designed Small-Molecule Inhibitors Targeting an Unconventional Pocket on the TLR8 Protein-Protein Interface

针对 TLR8 蛋白质-蛋白质界面上非常规口袋的合理设计的小分子抑制剂

• DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b02128
• 发表时间: 2020-04-23
• 期刊: JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY
• 影响因子: 7.3
• 作者: Jiang, Shuangshuang;Tanji, Hiromi;Yin, Hang
• 通讯作者: Yin, Hang

TLR3は効率的なシグナル伝達のためにdsRNA上で多量体を形成する

TLR3 在 dsRNA 上形成多聚体以实现有效的信号转导

• 发表时间: 2022
• 作者: 江部日南子;千葉貴之;高橋佳人;佐藤純;大久哲;城戸淳二;Tomohito Nakayama;坂庭 賢太朗，柴田 琢磨，重松 秀樹，山本 雅貴，三宅健介，大戸梅治，清水敏之
• 通讯作者: 坂庭 賢太朗，柴田 琢磨，重松 秀樹，山本 雅貴，三宅健介，大戸梅治，清水敏之