人工金属錯体を有するヘム酵素の開発および高難度酸化反応の達成

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本申請課題では反応中心であるヘム補因子を合成金属錯体に置換することによるP450BM3の高機能化を目標とした．前年度の検討ではマンガンプロトポルフィリンIX結合型P450BM3（Mn-BM3）の高活性な変異体I401Pを発見した．そこで本年度はこのI401P変異体を起点とし，高機能化に向けた変異体の検討を行った．ラジカルクロック基質を用いた検討により，F87A変異の導入によって反応中間体であるアルキルラジカル種を長寿命化することを発見した．この結果は，ヘム上部に位置する87番目のフェニルアラニンが、立体障害の低いアラニンに置換されることによって，反応中間体のアルキルラジカル種に対する空間的な制御が緩和されたことによるものだと推測される．アルキルラジカル種は種々のC-H結合官能基化反応の中間体として知られ，その長寿命化を促進するF87A変異体を用いることにより，Mn-BM3による種々の非天然反応への展開が期待できる．前年度に引き続き，触媒サイクルの律速段階を調査するために速度論的同位体効果（KIE）の測定を行った．前年度の検討では，①「非競合試験」と，②「分子間競合試験」を行い，いずれの実験においてもKIEは観測されないことが確認された．そこで本年度の検討では，③等価反応点の重水素化基質を用いて反応を行い生成物比から分子内競合を求める「分子内競合試験」を実施した．その結果，野生型（ヘム結合型）P450BM3を用いた場合とMn-BM3を用いた場合のいずれにおいても大きな分子内KIEが観測された．①，②，③の結果から，Mn-BM3による水素原子引抜き過程は十分素早く進行しており，触媒サイクルの律速ではないことが推定される．したがって，水素原子引抜き以外の反応過程（例えば，基質分子のタンパク質に対する結合過程，酸化活性種の生成過程）が触媒サイクルの律速であることが推定される．