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基質模倣物による水酸化酵素の制御を利用した菌体内物質変換系の開発

利用底物模拟物控制羟化酶开发细胞内物质转化系统

基本信息

批准号：
19J23669
负责人：
唐澤昌之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

水酸化酵素であるP450BM3 (BM3) は、擬似基質（デコイ分子）によって基質特異性を変換できる。これまでに、BM3を発現させた大腸菌にデコイ分子を取り込ませることで、菌体内の補酵素再生系を利用して非天然基質の水酸化が進行することを明らかにしている。また、外膜タンパク質OmpFの変異体をBM3と共発現させることで、菌体反応が促進されることを見出している。OmpF変異体の機能を精査するため、ピレンを部分骨格として有するデコイ分子を模した蛍光分子を合成し、大腸菌への取り込みを評価した。蛍光分子を大腸菌の懸濁液に加えてインキュベートし、顕微鏡で観察したところ、OmpF変異体を発現させた大腸菌からのみ明瞭な蛍光が観測された。また、培養後の上清の紫外可視吸収スペクトルを測定し、蛍光分子の吸収から菌体への取り込み効率を算出したところ、野生型OmpFを発現させた大腸菌では取り込み効率が11%であったのに対し、OmpF変異体を発現させた場合では74%に増加した。以上の結果から、OmpF変異体が擬似基質の取り込みを促進していることが示唆された。また、天然物が擬似基質として機能するかを調査するため、アシルホモセリンラクトン(CnHSL)とアシルホモセリン(CnHS)の存在下、BM3によるベンゼンの水酸化を行った。AHSLの中では炭素鎖8のものが、AHSの中では9のものが酵素反応を効果的に促進し、C9HSの存在下、BM3は毎分24回ベンゼンを酸化した。X線結晶構造解析から、C12HSLのラクトン環はC16HSのカルボキシ基よりもBM3の基質結合部位の奥に固定化されていることが明らかとなり、酵素反応で観測された鎖長依存性の差は、両者の結合状態の違いに起因していると推測している。菌体自身がデコイ分子を生合成する新しい菌体触媒の開発につながることが期待される。

Hydroacidifying enzyme P450BM3 (BM3) is a substrate-specific enzyme that mimics matrix molecules. This is the first time that BM3 has been discovered in Escherichia coli. It is the first time that the enzyme regeneration system in Escherichia coli has been used. It is not the natural substrate for acidification. The outer membrane of OmpF is different from that of BM3. OmpF has been carefully examined for its function as a foreign protein and evaluated for its ability to synthesize light molecules. Coliform suspension of light molecules is detected by microscope and OmpF is detected by light. In addition, the detection rate of ultraviolet visible absorption of supernatant after culture was calculated, and the detection rate of wild type OmpF was increased from 11% to 74%. The above results show that OmpF can be used to simulate the matrix selection process. In the presence of BM3, BM3 and BM4, the study of the function of natural substances in simulated substrates (CnHSL) and CnHS is carried out. AHSL has 8 carbon chains, AHS has 9 carbon chains, and BM3 has 24 carbon chains. X-ray crystallographic analysis of C12HSL shows that the reason for the difference in lock-length dependence and the binding state of C12HSL is presumed. The development of bacterial catalysts is expected to be a new process for the synthesis of bacterial molecules.