Photo-regulation of mitotic kinesin Eg5 function using photochromic inhibitors which have multiple photo-switching states

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これまでの研究において、二種類のフォトクロミック分子、スピロピランとアゾベンゼン誘導体をカップリングさせることにより紡錘体キネシンEg5の光応答性の阻害剤を調製している。そして複数の光異性化状態を形成する多段階光 スイッチ機構を持つEg5阻害剤SPSABは、VIS、UV、およびin the darkで、SP-Trans、MC-Cis、MC- Transの異なる3つの異性化状態を示した。 そしてSPSABのin vitro実験において、Eg5-ATPase活性は、強く、弱く、中程度に制御されることが示された。従来型キネシン共存下においてin vitro motility assayを行うこと により微小管と解離した状態でキネシン Eg5を阻害することが示されている。そこで、当該年度は、SPSAB がキネシンATP加水分解サイクルと運動サイクルのどのステップを阻害しているか、その阻害機構を明らかにする実験を行った。1. キネシンEg5のATP結合とADP解離のステップへの光スイッチング阻害剤の影響を調べるために、蛍光標識したATPアナログMant-ATPを用いた解析方法を確立することを行った。ADPの解離を阻害するEg5のモデル阻害剤を用いて解析方法が機能することを確認することができた。また、ATPからADPへ加水分解するステップの解析法の構築も試みた。2. キネシンEg5が微小管上を運動するサイクルのどのステップを光スイッチング阻害剤が阻害しているかを示すために、従来型キネシンと共存させたinvitro motility assay方の構築を行った。そして、2種類のモデルEg5阻害剤を用いてEg5が微小管と結合した状態あるいは微小管から解離した状態であるか示す方法を確立することができた。3. 新たな光スイッチングEg5阻害剤の合成を試みた。そしてスルホン化アゾベンゼンに二つのスピロピランを導入した複数の光異性化状態を形成する多段階光 スイッチ機構を持つ新規の化合物を合成することができた。