ミオシンATPaseの遷移状態を形成する複合体の^<19>F-NMRによる解析

^19F-NMR分析形成肌球蛋白ATP酶过渡态的复合物

• 批准号: 07780582
• 负责人: 丸田 晋策
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780582/
• 关键词: 筋収縮; ミオシンATPase; エネルギートランスダクション; 遷移状態アナログ; ATPアナログ; ^<19>F-NMR

(1)a.ATPアナログ2-[(4-trifluoro-methyl-2-nitrophenyl)amino]ethyl triphosphate(TFNTP)を用いて形成させたミオシン/TFNDP/AIF_4BeFn or Vi複合体の^<19>F-NMRスペクトルの化学シフトはそれぞれわずかであるが、異なっていた。TFNDPに非常に近い性質を持つ光架橋性のMant-2-N_3-ATPを用いた各複合体の光親和標識の実験結果は、各複合体においてプロテアーゼ消化によって得られる同じペプチドに架橋することが示されたので、活性部位において大きなコンホメーションの差はないと思われる。しかしTFNDPの^<19>F-NMRスペクトルはアミノ酸レベルでの小さな変化をとらえていることが示唆された。b.フッ素で標識した平滑筋ミオシン制御軽鎖のmutant(F22W)を遺伝子操作を用いて直接フッ素標識して^<19>F-NMRの測定を行なった。標識された制御鎖のスペクトルはフリーのものと異なる化学シフトを示し、特異的に標識された部位の構造をモニターできることが示唆された。またnativeミオシンと効率良くexchangeすることができた。今後、このミオシンを用いて複合体を形成させて^<19>F-NMRを測定する予定である。(2)ミオシン/ADP/AIF_4(BeFn,Vi)複合体を形成するミオシン頭部,Subfragment-1(S-1)の全体的な構造を調べるために、X線小角散乱法を用いて各複合体におけるS-1分子の慣性半径を小角領域のギニエプロット(散乱曲線を、強度の対数を縦軸に散乱ベクトルの大きさの二乗を横軸にプロットしたもの)の勾配から求めた。各複合体ともATPが結合したときと同程度の構造変化を起こしており、ミオシン頭部で折れ曲がりを示すような構造をすることが示唆された。また活性システイン残基Cys707(SH1)が存在する部位での、局所的な構造変化を調べるために、あらかじめ蛍光試薬ABDFで標識したミオシンを調製して、ADPと各リン酸アナグロを加えて各複合体形成に伴う構造変化を調べた。いずれの複合体においても同程度の構造変化を示していることが示された。各複合体はATPが結合したとき、遷移状態形成に近い構造変化をミオシン頭部全体及びSH1領域で起こしていることが示された。しかしながら、活性リジン(Lys83)の反応性はそれぞれ異なっていることから、これらの複合体は収縮サイクルにおいて遷移状態付近に類似しているが、わずかにずれたステップを示していると考えられる。

(1)a.ATP trifluoromethyl 2-[(4-trifluoro-methyl-2-nitrophenyl)amino]ethyl triphosphate(TPNTP) was synthesized by chemical reaction of ATP trifluoromethyl 2-[(4-trifluoro-methyl-2-nitrophenyl)amino]ethyl triphosphate(TPNTP)/TFNDP/AIF_4BeFn or Vi complex<19>. TFNDP has very close properties and maintains photobridging properties. The photoaffinity labeling results of each complex in the use of Mant-2-N_3-ATP show that the active site of each complex is different from that of the other complexes. The F-NMR spectrum of TFNDP <19>is different. b. The identification of the element is carried out by using the direct identification of the element and the determination of the <19>F-NMR. The identification of the target site is different from the chemical identification of the target site. The identification of the target site is different from the chemical identification of the target site. A native is a good exchange. In the future, the formation and determination of these complexes by <19>F-NMR were determined. (2)The structure of the whole complex of S-1/ADP/AIF_4(BeFn,Vi) was adjusted by X-ray small-angle scattering method. The inertia radius of S-1 molecule in each complex was adjusted by X-ray small-angle scattering method. Each complex is bound to the same degree of structural transformation. The active residue Cys707 (SH1) is present in the site, and the structural changes in the site are modulated by the light test ABDF, and the structural changes in the complex formation are modulated by the addition of the active residue Cys707 (SH1). In the middle of the complex, the structure changes to the same degree. Each complex is composed of ATP binding, transition state formation, structural transformation, head and SH1 domain initiation. The activity of Lys83 is different from that of the complex. The transition state of Lys83 is similar to that of the complex.

项目成果

Maruta et al.: "Conformational change on myosin head induced by binding of ATP analogue which has “Syn" conformation at N-glyciside bond" Biophysical Journal. 70. 265 (1996)

Maruta 等人：“N-糖苷键上具有“Syn”构象的 ATP 类似物的结合诱导肌球蛋白头部的构象变化”《生物物理学杂志》70. 265 (1996)。

Maruta et al.: "Analysis of conforamtional change of smooth muscle myosin regulatory light chain accompanied with phosphorylation using ^<19>F-NMR" Biophysical Journal. 70. 267 (1996)

Maruta等人：“使用19F-NMR分析伴随磷酸化的平滑肌肌球蛋白调节轻链的构象变化”生物物理学杂志。