植物の環境ストレス耐性に関わる金属イオントランスポーターの構造基盤

参与植物环境胁迫耐受的金属离子转运蛋白的结构基础

• 批准号: 19K06526
• 负责人: 田中 良樹
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06526/
• 关键词: 結晶構造解析; 膜タンパク質; クライオ電子顕微鏡; 構造生物学; 輸送体タンパク質

初年度の時点で，サンプルの大量発現および精製方法の確立と結晶化スクリーニングを試みていたが、構造解析に必要な結晶化には成功していなかった。タンパク質構造を安定化させるため、抗体との共結晶化を行うことにした。抗体作製時に脂質と混合し、リポソーム再構成をすることでより構造を維持した抗原から構造認識抗体を得られるような工夫を施した。マウス腹水から結合可能性のある抗体候補を複数得ることができた。複数の抗体が得られたため、その中からサンプルと安定した強い結合を示す抗体を選択するため、それぞれをFab化後、サンプルと混合してゲル濾過することで単一の結合サンプルピークが得られるものの選別を行った。小スケールでの結合確認の結果、目的サンプルと十分な結合を示すFab化抗体が複数作製できたことを確認した。結合が確認できた抗体についてスケールを上げて、結晶化を行った。脂質キュービック法やバイセル法などの膜タンパク質輸送体に適した結晶化法を使用して結晶化を試み、微小結晶を得ることに成功し、回折実験に供した。いくつかの結晶化条件で予備的な低分解能データを得たが、分子置換可能なレベルのデータではなかった。それぞれ結晶化条件のリファインを行ったものの、分解能を向上するには至らず、立体構造の決定はできなかった。本研究期間中に全てのFab化抗体との組み合わせでの結晶化を実施できていないため、引き続き組み合わせを変え結晶化を行っていく必要があると考えている。

Early annual の point で, サ ン プ ル の large 発 now お よ の び refining method established と crystallization ス ク リ ー ニ ン グ を try み て い た が, tectonic analytical に necessary な crystallization に は successful し て い な か っ た. を タ ン パ ク mass structure stabilization さ せ る た め, antibody と の total crystallization を line う こ と に し た. When the antibody cropping に lipid と mixed し, リ ポ ソ ー ム reconstitution を す る こ と で よ り tectonic を maintain し た antigen か ら structure meet antibody を ら れ る よ う な time を し shi た. Youdaoplaceholder0 ウス ascites ら ら binding possibility ある ある antibody candidate を plurals る とがで とがで とがで た. Plural が の antibody to ら れ た た め, そ の in か ら サ ン プ ル と settle し た strong い combining を す antibody in を sentaku す る た め, そ れ ぞ れ を after the Fab, サ ン プ ル と mixed し て ゲ ル filtration す る こ と で 単 a の combining サ ン プ ル ピ ー ク が must ら れ る も の の line separating を っ た. Small ス ケ ー ル で の combined with the results of の, purpose サ ン プ ル と terribly な を shown す Fab antibody が complex as the system で き た こ と を confirm し た. Combining が confirm で き た antibody に つ い て ス ケ ー ル を げ on melt line を っ て, crystallization た. Lipid キ ュ ー ビ ッ ク method や バ イ セ ル method な ど の membrane タ ン パ ク mass transport body に optimum し た を crystallization method using し て crystallization を try み, tiny crystalline を る こ と に し success, back to the fold be 験 に for し た. で い く つ か の crystallization conditions can reserve な low decomposition デ ー タ を have た が, molecular replacement may な レ ベ ル の デ ー タ で は な か っ た. そ れ ぞ れ crystallization conditions の リ フ ァ イ ン を line っ た も の の upward, can decompose を す る に は to ら ず, three-dimensional structure の decided は で き な か っ た. In this study period に full て の Fab the antibody と の group み close わ せ で の crystallization を be applied で き て い な い た め and き 続 き group み close わ せ を - え crystallization を line っ て い く necessary が あ る と exam え て い る.