多剤排出輸送体MATEのX線結晶構造解析による認識と輸送における構造基盤の解明

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今年度の実験計画に基づき、古細菌由来多剤排出輸送体Multidrug And Toxic compound Extrusion(MATE)の結晶構造を明らかにするための実験を進行させた.前年度までの研究において,3Å分解能の回折を示す結晶を得ていたが,これに関して結晶化条件のリファインを進め,最高で2.4Å分解能のデータセットを収集に成功した.分子置換法による構造決定を試みたが,解が得られなかったため,SeMet置換体の結晶化・重原子異常分散を用いた位相決定を目指した.しかし,SeMet置換体は結晶化における性質が悪く,必要な大きさの結晶を得ることが不可能であった.そこで,特異的な結合能を示すペプチドを選択・合成し,それと共結晶化させる手法を用いることにした.これは小分子の結合により,タンパク質の動きが制限され,結晶化が促進される効果を狙ったものである.ペプチドとの共結晶化によりSeMet置換体においても回折実験に必要なだけの大きさに結晶は成長し,シンクロトロン放射光施設SPring-8における測定により,単波長異常分散法による位相決定に成功した.構造決定後は,単体での結晶構造および複数の結合ペプチドとの複合体構造を決定していった.その結果,いずれの結合ペプチドも細胞外側に開いた溝を標的に結合していること,ペプチドの配列により結合部位が異なることが明らかになった.また,選択された複数の結合ペプチドのin vivoにおける機能について検証をおこなうための実験系を構築し,基質輸送阻害活性が存在するかを確認した.その結果,うち一つに強い阻害活性が確認され,決定した立体構造から予想される結合様式との関連性が見出された.現在,変異体解析を含む生化学的実験を実行しつつ,論文の投稿準備を進めている.