多剤排出輸送体MATEのX線結晶構造解析による認識と輸送における構造基盤の解明

通过X射线晶体结构分析阐明多药外排转运蛋白MATE识别和转运的结构基础

• 批准号: 10J09122
• 负责人: 田中 良樹
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J09122/
• 关键词: X線結晶構造解析; 膜タンパク質; 構造生物学; 多剤排出輸送体

今年度の実験計画に基づき、古細菌由来多剤排出輸送体Multidrug And Toxic compound Extrusion(MATE)の結晶構造を明らかにするための実験を進行させた.前年度までの研究において,3Å分解能の回折を示す結晶を得ていたが,これに関して結晶化条件のリファインを進め,最高で2.4Å分解能のデータセットを収集に成功した.分子置換法による構造決定を試みたが,解が得られなかったため,SeMet置換体の結晶化・重原子異常分散を用いた位相決定を目指した.しかし,SeMet置換体は結晶化における性質が悪く,必要な大きさの結晶を得ることが不可能であった.そこで,特異的な結合能を示すペプチドを選択・合成し,それと共結晶化させる手法を用いることにした.これは小分子の結合により,タンパク質の動きが制限され,結晶化が促進される効果を狙ったものである.ペプチドとの共結晶化によりSeMet置換体においても回折実験に必要なだけの大きさに結晶は成長し,シンクロトロン放射光施設SPring-8における測定により,単波長異常分散法による位相決定に成功した.構造決定後は,単体での結晶構造および複数の結合ペプチドとの複合体構造を決定していった.その結果,いずれの結合ペプチドも細胞外側に開いた溝を標的に結合していること,ペプチドの配列により結合部位が異なることが明らかになった.また,選択された複数の結合ペプチドのin vivoにおける機能について検証をおこなうための実験系を構築し,基質輸送阻害活性が存在するかを確認した.その結果,うち一つに強い阻害活性が確認され,決定した立体構造から予想される結合様式との関連性が見出された.現在,変異体解析を含む生化学的実験を実行しつつ,論文の投稿準備を進めている.

This year's implementation of the project is based on the development of Multidrug And Toxic compound Extrusion(MATE) crystal structure. In the past year, the decomposition energy of 3-D crystals was obtained, and the crystallization conditions were improved, with the highest decomposition energy of 2.4-D crystals successfully collected. The molecular substitution method has been used to determine the structure, and the solution has been found, which shows that the crystallization and abnormal dispersion of heavy atoms of SeMet substitutes are used to determine the phase. It is impossible to crystallize the crystal of SeMet substitution. For example, the specific binding energy can be selected by co-crystallization. The crystallization of small molecules is promoted by the binding of small molecules, and the crystallization of small molecules is promoted by small molecules. The co-crystallization of SeMet substituent is necessary for the determination of the phase by the single-wavelength anomalous dispersion method. After the structure is determined, the crystal structure of the single body and the complex structure of the complex are determined. As a result, the binding site of the cell is different from that of the cell outside. In addition, the selection of a plurality of binding agents in vivo can be used to verify the existence of matrix transport inhibition activity. As a result, strong inhibition activity was confirmed, and the correlation between the three-dimensional structure and the association model was found. Now, all kinds of analysis including biochemistry are carried out, and the preparation of papers is advanced.