糖鎖修飾によるAMPA受容体の発現調節機構の解明

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本研究は、AMPA型グルタミン酸受容体（AMPA受容体）の糖鎖修飾が、如何にしてAMPA受容体の細胞膜への発現（移行）を制御しているのかを明らかにすることを目的としており、そのための手法として受容体分子の詳細な動態解析が可能な全反射蛍光顕微鏡（TIRF）法を用いる。研究実施計画は３つのステップからなり、前年度までに、①観察（TIRF）システムの構築についてはほぼ完了し、②糖鎖修飾を欠損させた変異型GluA1（N63Q、N363Q）に蛍光標識した発現ベクターの作製については、変異型GluA1のベースとなる野生型GluA1に蛍光タグ、EGFP（緑色蛍光タンパク質）を付けた発現ベクターを作製し、HEK293細胞への強制発現後、蛍光顕微鏡下においてGluA1-EGFPの蛍光シグナルを確認した。今年度においては、前年度に作製した野生型GluA1の発現ベクターが機能を保持しているか否かについて、電気生理学的手法を用いて確認を試みた。具体的には、この発現ベクタ－を用いてHEK293細胞へ強制発現させた後、EGFPの蛍光シグナルを持つHEK293細胞に対してホールセルパッチクランプ法を適用し、グルタミン酸に対する応答性を確認した。また、並行して野生型GluA1の発現ベクターをベースにEGFPで標識された変異型GluA1（N63Q、N363Q）の発現ベクターも作製した。さらに構築した観察システム（顕微鏡ステージ）に合わせたチャンバーの作製も行った。このチャンバーには灌流システムが付属しており、常時、細胞外溶液を灌流することにより、数時間、生きた細胞を観察することが可能となる。