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糖鎖修飾によるAMPA受容体の発現調節機構の解明

糖基化作用阐明AMPA受体表达调控机制

基本信息

批准号：
19K06941
负责人：
若園佳彦
金额：
$ 2.83万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、AMPA型グルタミン酸受容体（AMPA受容体）の糖鎖修飾が、如何にしてAMPA受容体の細胞膜への発現（移行）を制御しているのかを明らかにすることを目的としており、そのための手法として受容体分子の詳細な動態解析が可能な全反射蛍光顕微鏡（TIRF）法を用いる。研究実施計画は３つのステップからなり、前年度までに、①観察（TIRF）システムの構築についてはほぼ完了し、②糖鎖修飾を欠損させた変異型GluA1（N63Q、N363Q）に蛍光標識した発現ベクターの作製については、変異型GluA1のベースとなる野生型GluA1に蛍光タグ、EGFP（緑色蛍光タンパク質）を付けた発現ベクターを作製し、HEK293細胞への強制発現後、蛍光顕微鏡下においてGluA1-EGFPの蛍光シグナルを確認した。今年度においては、前年度に作製した野生型GluA1の発現ベクターが機能を保持しているか否かについて、電気生理学的手法を用いて確認を試みた。具体的には、この発現ベクタ－を用いてHEK293細胞へ強制発現させた後、EGFPの蛍光シグナルを持つHEK293細胞に対してホールセルパッチクランプ法を適用し、グルタミン酸に対する応答性を確認した。また、並行して野生型GluA1の発現ベクターをベースにEGFPで標識された変異型GluA1（N63Q、N363Q）の発現ベクターも作製した。さらに構築した観察システム（顕微鏡ステージ）に合わせたチャンバーの作製も行った。このチャンバーには灌流システムが付属しており、常時、細胞外溶液を灌流することにより、数時間、生きた細胞を観察することが可能となる。

In this study, we aim to investigate the mechanism of glyco-locking modification of AMPA-type acid receptor (AMPA receptor) and how to control the membrane transition of AMPA receptor, and to investigate the detailed dynamic analysis of AMPA receptor molecules using total reflection microscopy (TIRF). The research implementation plan includes three aspects: (1) the construction of TIRF system is completed;(2) the sugar lock modification is incomplete;(3) the abnormal GluA1 is not modified.(N63Q, N363Q), the discovery of the fluorescent marker, the discovery of the fluorescent marker and the discovery of EGFP (green fluorescent protein) in wild-type GluA1, the discovery of the fluorescent marker and the discovery of the fluorescent marker in HEK293 cells, and the confirmation of the fluorescent marker of GluA1-EGFP under fluorescent microscopy. This year, the wild type GluA1 was produced and its function was maintained. The electrophysiological method was used to confirm it. Specifically, the EGFP gene expression system was used to confirm the response of HEK293 cells to cell stress. In addition, the expression of wild-type GluA1 (N63Q, N363Q) was determined by EGFP. This is the first time I've ever seen one of those things. In this case, the perfusion system allows extracellular solution to be perfused at any time, and it is possible to observe raw cells for several times.