The regulation mechanisms of B. pertussis fimbriae gene expression

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百日咳菌の線毛遺伝子fim3は複雑な発現制御機構下に置かれている。fim3遺伝子の上流(Pfim3領域)には特徴的なpolyC配列が存在するが、我々はこれまでにPfim3 polyC ≧14Cの場合はfim3遺伝子がvag (virulence-associated gene)、≦13Cの場合はvrg (virulence-repressed gene)として機能することを明らかにした。さらにfim3がvrgとして機能するにはリプレッサーBvgRおよびアクチベーターRisAの制御を受けることが示唆された。本研究は、fim3発現におけるRisAの制御機構を明らかにすることを目的とする。まず、組換えRisAタンパク質の精製方法を検討した。当初は組換えRisAの可溶化のため尿素含有の条件で精製していたが、尿素の存在によりRisAが本来とは異なる構造をとっている可能性が指摘された。そこで、可溶化剤不含有条件でのタンパク質精製を行なった。次に、得られた組換えRisAを用いた結合解析により、RisAが特異的にPfim3 poly-13Cに結合することを明らかにした。ただし、これまでの遺伝子発現解析により、RisAがアクチベーターとして機能する際にリン酸化およびc-di-GMPの関与が示唆されており、これら因子の存在によりRisAのPfim3-DNAへの結合が促進されることが予想された。そのため、次にRisAのリン酸化および検出条件の検討を行った。20 mMアセチルリン酸リチウムカリウム（リン酸基供与体）でRisAを処理すると、Phos-tag SDS-PAGEによりリン酸化されたRisA（RisA~P）が検出された。一方、RisA変異体ではリン酸化によるバンドのシフトアップは認められなかった。c-di-GMPはRisAのリン酸化に影響を与えなかったことから、c-di-GMPはRisA-PがPfim3へ結合する際に関与するものと考察された。