悪性高熱症の遺伝子診断を目指した1型リアノジン受容体遺伝子変異体の作製と発現

用于恶性高热基因诊断的1型兰尼碱受体基因突变体的创建和表达

• 批准号: 19K09383
• 负责人: 小口 勝司
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K09383/
• 关键词: 悪性高熱症; 1型リアノジン受容体; 遺伝子変異体; 変異体; リアノジン受容体; malignant hyperthermia; ryanodine receptor; cDNAカセット; cDNA cassette; カルシウムイオン; calcium ion; malignant hyperthe; 遺伝子診断

細胞内カルシウム(Ca2+)放出チャンネルである1型リアノジン受容体(RyR1)をコードするcDNAの塩基配列に、悪性高熱症(malignant hyperthermia、MH)患者の症例報告にあるアミノ酸配列の変異に相当する塩基置換を施したMH型RyR1cDNA変異体を作製するためのPCRプライマーを、Web上の塩基配列デザインツール等を用いて、デザインし、PCRによるRyR1cDNAカセットを利用したMH変異部位特異的変異体の作製を行ってきた。さらに、これらをテトラサイクリン誘導性に外来遺伝子発現の制御が可能な培養細胞株(Flp-In TRex293等)に遺伝子導入して、数種のMH型RyR1発現細胞株を樹立した。このMH型RyR1変異体発現細胞に対して、正常なコントロールとなり得る野生型(Wild Type、WT)RyR1を発現した細胞における細胞内Ca2+動態と比較しながら薬物感受性の変化等をスクリーニングして解析するシステムの構築を目指して実験を続けている。尚、このMH型変異を導入したRyR1cDNAカセットを使って共同研究(鈴木団：大阪大学、山澤徳志子：慈恵医科大学、順天堂大学、昭和大学、他)を行ない、MH病態における暴走的な熱産生メカニズムの起源が、骨格筋細胞のCa2＋放出チャンネルであるRyR1において、遺伝的アミノ酸変異により、体温上昇(発熱)に対して過敏に応答してしまう「熱誘発性Ca2＋放出（Heat-induced Ca2+ release）機構」にあることを新たに発見して公表することができた。このメカニズムは、一部の労作性熱中症の発症とも関連する事から、新たな治療薬の開発に繋がると期待されている。

Intracellular Ca2 + release from the cell is a type 1 receptor for the expression of the cDNA gene, which is associated with hyperthermia.(Malign hyperthermia, MH) Patient case reports on the use of gene substitutions in the production of gene variants of the MH type RyR gene. PCR amplification of RyR1 cDNA was carried out using a site-specific variant. In addition, it is possible to control the expression of inducible foreign genes in cultured cell lines (Flp-In TRex293, etc.), and several MH type RyR1-producing cell lines have been established. The MH-type RyR1 variant is found in wild type (Wild Type, WT) RyR1 variant cells, and the intracellular Ca2 + dynamics in these cells are compared to those in normal cells. A Joint Study on the Introduction of RyR1 cDNA into Human Genome (Suzuki: Osaka University, Tokushiko Yamazawa: Shikoku Medical University, Shuntendo University, Showa University, etc.), MH Pathology, Ca2 + Release, RyR1 Pathology, MH Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, RyR1 Pathology, RyR2 Pathology, The mechanism of heat-induced Ca2 + release is a new phenomenon in response to the rise of body temperature (heat). The development of new therapies is expected to be associated with the development of a number of active febrile diseases.

项目成果

Insights into channel modulation mechanism of RYR1 mutants using Ca2+ imaging and molecular dynamics

• DOI: 10.1085/jgp.201812235
• 发表时间: 2019-12
• 期刊: The Journal of General Physiology
• 作者: T. Yamazawa;H. Ogawa;T. Murayama;M. Yamaguchi;H. Oyamada;Junji Suzuki;N. Kurebayashi;Kazunori Kanemaru;K. Oguchi;Takashi Sakurai;M. Iino

Fast and easy construction method of ryanodine receptor mutants aiming at genetic screening of malignant hyperthermia diagnosis

针对恶性高热诊断基因筛查的快速简便的兰尼碱受体突变体构建方法

• 发表时间: 2020
• 作者: Oyamada H;Nakano M;Hayashi T;Ubukata Y;Makino T;Tanaka M;Kikuchi T;Oguchi K;Kiuchi Y.
• 通讯作者: Kiuchi Y.

熱中症の発症予測・メカニズム解明にも寄与 : 悪性高熱症の熱産生暴走メカニズム（大阪大）

有助于预测中暑的发生并阐明其机制：恶性高热中产热失控的机制（大阪大学）

熱中症の発症予測・メカニズム解明にも寄与:悪性高熱症の熱産生暴走、、、(量子科学技術開発研究機構)

有助于预测中暑的发生并阐明其机制：恶性高热中的失控产热（量子科学技术研究机构）

Construction and integration of the All-in-One type single double-conditional shRNA expression vectors for spatio-temporal gene and/or cell targeting.

用于时空基因和/或细胞靶向的 All-in-One 型单双条件 shRNA 表达载体的构建和整合。

• 发表时间: 2019
• 作者: Oyamada H;Ao Y;Kudo Y;Matsuoka T;Okamoto R;Murayama T;Yamazawa T; Kakizawa S;Oguchi T;Kimura MA;Yasumoto T;Mori Y;Tsuji M;Oguchi K;Kiuchi Y.
• 通讯作者: Kiuchi Y.