生きた細胞におけるカルシウム放出チャンネル蛋白質の可視化

(1) ウサギ骨格筋より得られたリアノジン受容体(RyR1)をコードするcDNA(全長約16キロベース)に唯一ケ所でしか切断しない制限酵素部位をアミノ酸配列に変異を生じない様に導入して、制限酵素により小さなcDNAカセット(約1.5キロベース)毎に切り抜いて利用できる「カセット化」を行った。(2) カセット化したcDNA中に緑色蛍光蛋白質(Green fluorescent protein、GFP)のcDNAを組み込み、GFP融合RyR1蛋白質を培養細胞(HEK293、CHO細胞)に強制発現させた。その結果、CICRチャンネルの本体であるRyR1のアミノ基(N)末端、カルボキシル基(C)末端(C末端より14アミノ酸削除したものとC末端完全長のもの)、及びD2領域(N末端より1397番目のアミノ酸位)にGFPを融合させた蛋白質が、生きたままの細胞で細胞質に点在するRyR1の発現/分布が可視化できるようになった。また、RyR1作用薬である4-chloro-3-ethylphenol(4-CEP)によるCa^<2+>放出能の有無を調べたところ、RyR1のC末端、N末端にGFPを融合させた蛋白質を発現させた細胞では4-CEPによるCa^<2+>放出能が損失、もしくは強く抑えられていた。4種類のGFP融合RyR1蛋白質の内、D2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させた細胞だけが4-CEPによるCa^<2+>放出機能を保持していたので、このD2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させる実験方法を用いれば、GFP蛍光による詳細なRyR1の細胞内分布と発現量の解析ができ、同時に細胞内Ca^<2+>シグナルの空間・時間的な変化の関係を調べることも可能であるが判った。

(1) ウサギ骨格筋より得られたリアノジン受容体(RyR1)をコードするcDNA(全長約16キロベース)に唯一ケ所でしか切断しない制限酵素部位をアミノ酸配列に変異を生じない様に導入して、制限酵素により小さなcDNAカセット(約1.5キロベース)毎に切り抜いて利用できる「カセット化」を行った。(2) カセット化したcDNA中に緑色蛍光蛋白質(Green fluorescent protein、GFP)のcDNAを組み込み、GFP融合RyR1蛋白質を培養細胞(HEK293、CHO細胞)に強制発現させた。その結果、CICRチャンネルの本体であるRyR1のアミノ基(N)末端、カルボキシル基(C)末端(C末端より14アミノ酸削除したものとC末端完全長のもの)、及びD2領域(N末端より1397番目のアミノ酸位)にGFPを融合させた蛋白質が、生きたままの細胞で細胞質に点在するRyR1の発現/分布が可視化できるようになった。また、RyR1作用薬である4-chloro-3-ethylphenol(4-CEP)によるCa^<2+>放出能の有無を調べたところ、RyR1のC末端、N末端にGFPを融合させた蛋白質を発現させた細胞では4-CEPによるCa^<2+>放出能が損失、もしくは強く抑えられていた。4種類のGFP融合RyR1蛋白質の内、D2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させた細胞だけが4-CEPによるCa^<2+>放出機能を保持していたので、このD2領域後半部位にGFPを融合させたRyR1を発現させる実験方法を用いれば、GFP蛍光による詳細なRyR1の細胞内分布と発現量の解析ができ、同時に細胞内Ca^<2+>シグナルの空間・時間的な変化の関係を調べることも可能であるが判った。