Biochemische und elektrophysiologische Charakterisierung des Aquaporin-Kationenfilters

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Wir haben durch wenige (1–3) Punktmutationen in Aquaporinen physiologisch relevante Leitfähigkeiten für Protonen, Ammonium, Kalium- bzw. Natriumionen erzeugt. Es ist also erstmals gelungen, den Aquaporin-Kationenfilter im Protein zu lokalisieren und zu zerstören. Beteiligt ist nicht nur die zentrale Porenregion (Asparagin-Prolin-Alanin-Sequenzmotiv) sondern auch die Engstelle am Poreneingang (aromatische Arginin-Region). Diese experimentellen Daten ermöglichen es nun, die existierenden theoretischen Modelle, die meist die zentrale Region allein für den Kationenausschluss verantwortlich machen, zu überprüfen. In der Fortsetzungsphase des Projekts werden wir die erhaltenen Aquaporin-Mutanten u.a. von Säuger-AQP1, Toxoplasma TgAQP und Plasmodium PfAQP in geeigneten Zellen (E. coli, Hefe, Xenopus Oocyten, Säugerzellen) exprimieren. Zudem werden wir den Einfluss von aromatischen Resten auf den Ionentransport (Kationen--Interaktion) durch Mutationen untersuchen. Wir werden phänotypische Hefe-Assays (Ammonium, Kalium), Elektrophysiologie mit Oocyten (Protonen, Ammonium, Natrium, Chlorid), osmotische stopped-flow Assays (Wasser, Glycerol) sowie zelluläre Assays zum Protonenfluss mit pH-sensitivem green fluorescent protein (pHlourin) etablieren und die Leitfähigkeiten analysieren.