Rett症候群における新規のエピジェネティックな生理活性物質産生メカニズムの解明

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雄のmecp2遺伝子欠損マウス(mecp2-/y)で得られた生理活性物質の変化を、in vitroにて安定的に再現できる細胞株を作製することができた。方法としては、shRNA-mecp2を搭載したレンチウィルスベクター感染によるRNAi法により候補組織の培養細胞においてmecp2遺伝子ノックダウンを行い、細胞分取によりmecp2遺伝子ノックダウン細胞の純化株を作製し、生体で見られた現象を再現することを可能とした。純化株を増殖させてストックした後、継代数を合わせて実験を行うことで、非常に安定的な実験を行うことができた。現在このmecp2ノックダウン細胞でこの物質の生合成経路に関係する遺伝子群、あるいはそのプロモーター領域を網羅的に分子生物学的手法(定量PCR、Western blottingなど)にて確認中である。さらに上述に加え、mecp2遺伝子の発現レスキュー実験に着手し、内因性mecp2のノックアウト及び外因性mecp2発現レンチウィルスベクター(mecp2遺伝子の置き換えベクター)を構築し導入させて、上記と同種の細胞に感染させライン化を試みた。しかしながら、mecp2遺伝子を高発現させることにより細胞の増殖に影響が見られたため、こちらについては未だ細胞を安定して使用できていない状況である。今後なんとか改良し、細胞株を安定化させ、mecp2発現とそれに伴う上記生理活性物質の生合成経路に関する遺伝子群の発現変動を評価する予定である。さらに、in vitroの系でmecp2ノックダウン細胞からTotal RNAを抽出し、マイクロアレイ解析(mRNAおよびmiRNA発現解析)とデータマイニングを行うための準備を進めている。また、ChIPシークエンスを実施し、MeCP2蛋白とゲノ全体のDNA結合部位を同定することにより、MeCP2蛋白の結合遺伝子を確定させ、対象細胞における産生物質合成経路の遺伝子制御ネットワークを解明するための計画・準備を行っている。