細胞上のホルモン様FGF－クロトー－受容体複合体の電子顕微鏡による立体構造決定

使用电子显微镜测定细胞上激素样 FGF-Klotho 受体复合物的三维结构

• 批准号: 16K14689
• 负责人: 橋本 康史
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Foundation for Biomedical Research and Innovation
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K14689/
• 关键词: 立体構造; シグナル伝達; 蛋白質

本研究では、細胞に発現させたクロトー、FGF受容体を、細胞外から加えたプロテアーゼで切断し、細胞上清に遊離させて、回収した後、立体構造を決定する計画である。まず、切断、遊離を行う条件の検討を行った。アルファクロトー、ベータクロトー、FGF受容体１、FGF受容体4の各タンパク質の「細胞膜外側の膜直上から次のドメインまでの間のリンカー領域」に、「プロテアーゼが認識し、切断する配列」と「切断後のタンパク質を回収するためのタグの配列」を、タンパク質の全長を変えることなく導入し、切断されるかを試した。しかし、それらのタンパク質は、プロテアーゼによって切断されなかった。切断されない理由として、プロテアーゼ認識切断配列の位置が細胞膜もしくはドメインから近すぎること、もしくは、細胞膜とドメインとの間の隙間が狭すぎることにより、プロテアーゼが接近できないためではないかと考えた。FGF受容体４を用いて、リンカー部を延長するとともに、プロテアーゼ認識切断配列を複数個所導入したものを、延長程度を変えて複数作製し、検討を行った。その結果、リンカー部を３倍以上に延長した場合、プロテアーゼにより切断されることが分かった。この「FGFR受容体４の３倍延長リンカー」を用いて、他のタンパク質のリンカー部を延長し、プロテアーゼ認識切断配列とタグを導入したところ、プロテアーゼにより切断された。以上により、切断の条件は決定できた。しかし、培養細胞の細胞上清中にプロテアーゼを加えても、細胞にはそれらのタンパク質が多量に発現しているにも関わらず、細胞上清には切断されたタンパク質がほとんど検出されなかった。それらのタンパク質の細胞表面量の解析を行ったところ、細胞表面量は少なく、大半は細胞内に存在していた。これが上清にほとんど検出されない理由と考えられるため、発現や遊離の方法について、さらなる条件検討が必要である。

在这项研究中，表达Cloto和FGF受体的细胞被从外部添加的蛋白酶裂解，释放到细胞上清液中，然后收集，并确定三维结构。首先，检查了切割和解放的条件。将“蛋白酶识别和切割的序列”和“恢复蛋白质切割的序列”引入了“细胞膜外膜与蛋白质alpha cloto，beta cloto，beta cloto，beta cloto，fgf受体1的接头之间的接头区域”，而无需更改蛋白质的蛋白质。但是，这些蛋白质并未被蛋白酶裂解。我们认为无法裂解的原因是蛋白酶识别裂解序列离细胞膜或结构域太近，或者是因为细胞膜和结构域之间的间隙太窄，从而阻止了蛋白酶接近。使用FGF受体4，扩展了多个接头部分，并在不同的扩展水平下引入了多个蛋白酶识别裂解序列，并研究了结果。结果，发现如果连接器部分延伸到三次或更多，则被蛋白酶裂解。这种“ FGFR受体4的3倍延伸接头”用于扩展另一种蛋白质的接头部分，当引入蛋白酶识别裂解序列和TAG时，蛋白酶被蛋白酶切割。因此，可以确定切割的条件。但是，即使将蛋白酶添加到培养细胞的细胞上清液中，尽管在细胞中表达了大量这些蛋白质，但在细胞上清液中几乎没有检测到裂解的蛋白质。当分析这些蛋白的细胞表面量时，细胞表面量很小，并且大多数存在于细胞中。这被认为是在上清液中很少检测到的原因，因此必须研究进一步的条件以进行表达和释放方法。